Mendel je imao sreće s graškom. Afrička žaba i riba za identifikaciju čovjekovih gena imaju u istraživanjima poseban status. Čime ga zaslužuju

Kada se čovjek u funkcionalnom smislu rastavi na najelementarnije biokemijske procese, poput razgradnje hranjivih tvari, stvaranja energije za rad stanica i slično, onda na toj razini nema puno razlike između spomenutih organizma i nas, piše Tamara Čačev. Jasno je da postoje etičke prepreke u eksperimentima na čovjeku, no što karakterizira izabrane organizme?

• dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković

Kada se osvrnemo na prethodnih stotinjak godina, gotovo je nevjerojatno koliko je razumijevanje prirodnih procesa i svijeta u kojem živimo napredovalo. Što je uopće znao prosječan stanovnik ovog planeta netom izašao iz Velikog rata i usred pandemije Španjolske gripe i što mu je uopće bilo dostupno u praktičnom smislu od tadašnje znanosti? Mnogi će reći kako niti naš prosječni suvremenik nema puno više pojma o tim temama, dapače, u moru informacija koje nas okružuju, ponekad se čini kao da nastupa i svojevrsna regresija pa tako imamo bujanje antivakcinacijskih pokreta te raznih alternativnih i pseudoznanstvenih ideja. Ipak, bez obzira na to što ljudi znaju ili misle da znaju, nepobitna činjenica jest da nas zahvaljujući eksplozivnoj akumulaciji znanstvenih otkrića na ovoj planeti danas ima neusporedivo više, a životni uvjeti su se (iako ne svima) neusporedivo poboljšali pa u prosjeku živimo i dvadesetak godina duže u odnosu na „nesretnike“ s početka ove priče.

Kada se govori o znanstvenim otkrićima u biologiji i biomedicini onda se uglavnom govori o velikim znanstvenicima koji su nas zadužili svojim genijalnim idejama, no ovim tekstom želim skrenuti pažnju na čitav niz modelnih organizama bez koji ova otkrića i taj veliki napredak ne bi bili mogući. Svima su vjerojatno bliske asocijacijske i epidemiološke studije u kojima se na temelju podataka i uzoraka sakupljenih od dobrovoljnih sudionika, oboljelih  od različitih bolesti ali i zdravih pojedinaca, dolazi do ideja o uzročnicima, patofiziološkim i fiziološkim procesima te etiologiji pojedinih bolesti. No, opažanja dobivena ovakvim studijama potrebno je razložiti na temeljne biološke procese koji se nalaze u njihovoj podlozi a to nije moguće bez korištenja staničnih kultura u in vitro uvjetima te u konačnici modelnih organizama.

Mendel je imao sreće s graškom

Svi su u školi učili osnove genetike i Mendelove zakone nasljeđivanja kroz priču o Gregoru Mendelu i njegovim eksperimentima na grašku koji su primjer kako se znanje statistike lijepo spojilo s opažanjima u biologiji. Danas znamo da je Mendel pri odabiru graška kao modelnog organizma imao jako puno sreće upravo zbog toga što je odabrao svojstva koja su kod graška binarno definirana odnosom dominantnosti i recesivnosti. No, većina svojstava nisu tako binarno određena, te da je Mendel uzeo neku drugu biljku i promatrao visinu stabljike, boju cvijeta i slično, možda ne bi bio zlatnim slovima upisan u povijest genetike.¹

Danas imamo na desetine modelnih organizama ovisno o području biologije i biomedicine, te se neki koriste u istraživanjima relevantnim za biologiju biljaka (npr.  biljka Arabidopsis) što je svakako od velikog značaja za poljoprivredu i prehrambenu industriju, drugi su organizmi podesni za istraživanja u mikrobiologiji (npr. E.coli, Salmonella ili bakteriofag T4), dok su za istraživanja u biomedicini i farmaceutskoj industriji zahtjevi koji se postavljaju pred modelne organizme opet drugačiji. ^2,3

Afrička žaba

Što su to onda modelni organizmi i kako padne odluka da neka egzotična ribica ili neka mušica predstavlja dobar model za proučavanje bioloških procesa koji su relevantni za čovjeka? Možemo reći kao postoje neke karakteristike koje određeni organizam mora posjedovati kako bi bio podesan za korištenje u znanstvenim istraživanjima. Modelni organizmi su najčešće vrste koje su široko prihvaćene u istraživanjima zbog jednostavnosti uzgoja i održavanja u laboratorijskim uvjetima. Općenito su za rad zahvalne vrste male do srednje veličine s velikim brojem potomstva, kratkim generacijskim vremenom (vrijeme potrebno da se dosegne spolna zrelost) te se tako u kraćem vremenskom razdoblju mogu istraživati biološki procesi koji kod čovjeka traju desetljećima, poput primjerice starenja. Drugi bitan uvjet jest što jednostavniji i jeftiniji uzgoj na malom prostoru te jednostavna manipulacija jedinkama. Tako su primjerice istraživanja u embriologiji, kojima danas možemo zahvaliti i uspjeh metoda potpomognute oplodnje obilježile vrste poput primjerice afričke žabe Xenopus laevis ili pilića čiji su embriji prilično otporni i relativno jednostavni za rad u  eksperimantalnim uvjetima.^4,5 Naravno, u novije vrijeme za najčešće korištene modelne organizme odsekvenciran je i njihov genom te je i postojanje informacije o genetičkom kodu nekog organizma jedan od bitnih čimbenika pri njihovom odabiru.

Zbog svoje kompaktnosti i vrlo malog udjela repetitivnih i nekodirajućih dijelova ali i činjenice da ima jednak broj kromosoma kao i čovjek, genom ribe Takifugu rubripes služi kao tzv. referentni genom za identifikaciju gena u genomu čovjeka i drugih kralježnjaka u komparativnim genetičkim studijama

U nekim se slučajevima kao modelni organizam koriste vrste koje imaju neku specifičnu evolucijsku poziciju ili posebne osobine vezane uz neki ključan korak u razvoju vrsta. Primjer takvog organizma je riba Takifugu rubripes koja ima izrazito mali genom koji je bio drugi genom kralježnjaka koji je javno objavljen (2002.g.) nakon genoma čovjeka.  Zbog svoje kompaktnosti i vrlo malog udjela repetitivnih i nekodirajućih dijelova ali i činjenice da ima jednak broj kromosoma kao i čovjek, genom ove ribe služi kao tzv. referentni genom za identifikaciju gena u genomu čovjeka i drugih kralježnjaka u komparativnim genetičkim studijama. Drugim riječima, gene koji postoje u ovoj ribi moguće je prema sličnosti u sekvenci DNA pronaći u genomima drugih životinja i obratno te tako olakšati proces njihove identifikacije.

Thomas Morgan, pionir moderne genetike posvetio je skoro svu svoju profesionalnu karijeru istraživanjima koristeći model vinske mušice Drosophile melanogaster

U klasičnoj genetici, nekad a i danas, od velike su koristi modelni organizmi s brojnom populacijom i kratkim generacijskim vremenom tako da se križanja jedinki mogu provoditi u brojevima koji su statistički relevantni, a eksperimenti se mogu ponoviti u nekom razumnom vremenu tijekom kojeg možemo sakupiti i po nekoliko generacija križanaca. Razmislimo, koliko treba vremena da se napravi neka transgeneracijska studija u ljudskoj populaciji. Ako na tren zanemarimo svu kompleksnost genetike čovjeka, naravno da bi se susreli s čitavim nizom izazova od primjerice smrtnosti samih znanstvenika do neizvijesnosti financiranja takvih dugogodišnjih studija kao i varijabilnim interesom samih ispitanika da kroz generacije u njima sudjeluju. Također za istraživanja funkcije pojedinih gena od neprocijenjive vrijednosti je i mogućnost njihihove ciljane inaktivacije kako bi se proučavala njihova funkcija.

Upravo u vrijeme onog prosječnog stanovnika Zemlje s početka priče, Thomas Morgan, pionir moderne genetike posvetio je skoro svu svoju profesionalnu karijeru istraživanjima koristeći model vinske mušice Drosophile melanogaster. Odabir nije bio nasumičan jer su u to vrijeme nakon što je ponovno otkriven Mendelov rad i drugi znanstvenici pokušavali pronaći materijalnu osnovu nasljeđivanja. Zbog jasno vidljivih vanjskih karakteristika (npr. crvene i bijele boje očiju, različitog izgleda ženskih i muških jedinki), relativno jednostavnog stvaranja mutanata različitog fenotipa, te malog broja prilično velikih kromosoma koje je bilo lakše proučavati u začecima genetike vinska mušica je u to vrijeme bila pametan izbor.^6,7

Upravo zahvaljujući tim karakteristikama Morgan je otkrio kako su kromosomi one strukture u stanici pomoću kojih se geni prenose tijekom diobe te je tako ova mušica postala prvi ekstenzivnije korišteni modelni organizam u modernoj biologiji. Svojim istraživanjima nadogradio se na Mendela i tako dao eksperimentalnu potvrdu kromosomske teorije nasljeđivanja kojom se objašnjavaju mehanizmi koji su u podlozi Mendelovih zakona nasljeđivanja te je za svoj rad 1933. godine dobio i Nobelovu nagradu. O tome vjerojatno nije znalo puno ljudi toga vremena, a korist od tih spoznaja bila je minimalna za ondašnjeg čovjeka. No ljepota znanosti jest da kad nađeš odgovor na jedno pitanje otvara se na stotine drugih, a odgovori od čiste fundamentalne vrijednosti često u konačnici ostave nemjerljive praktične posljedice na generacije koje dolaze. Tijekom vremena, uz vinsku mušicu, u ovim istraživanjima su najviše su korišteni kvasac Saccharomyces cerevisiae (sjetimo se koliko malo vremena treba da se dizano tijesto udvostruči zahvaljujući umnažanju kvasca), oblić (što bi se pogrešno moglo nazvati crvom) Caenorhabditis elegans i od 60-tih godina prošlog stoljeća riba zebrica Danio rerio.^8,9,10

No, kako je moguće da ovi naizgled evolucijski jako udaljeni organizmi mogu koristiti za fundamentalna genetička istraživanja i kako to da se spoznaje dobivene korištenjem ovih modelnih organizama mogu primijeniti i na ljude? Odgovor leži  u evoluciji. Naime, osnovni biološki procesi od esencijalne važnosti za funkcioniranje svake stanice kodirani su u najranijim danima razvoja života na Zemlji. Kada se čovjek u funkcionalnom smislu rastavi na najelementarnije biokemijske procese, poput razgradnje hranjivih tvari, stvaranja energije za rad stanica i slično, onda na toj razini nema puno razlike između spomenutih organizma i nas. Stoga se spoznaje dobivene proučavanjem ovih modelnih organizama gotovo mogu kopirati na funkcije koje su prisutne u stanicama čovjeka. Tako su čak i geni koji kodiraju neke od najvitalnijih procesa u našim stanicama gotovo neizmijenjeni kroz tisuće godina evolucije jer su se očito pokazali kao dobar funkcionalni sklop za održavanje života. Upravo na takvim esencijalnim funkcionalnim biološkim sklopovima temelji se i sintetska biologija o kojoj sam već pisala, s idejom da se temeljni biološki procesi mogu de novo sastaviti u „umjetnoj stanici“. Možda bismo danas mogli odabrati i neke druge organizme za ovaj tip istraživanja jer nam tehnologija i nove spoznaje omogućuju detaljniji uvid u njihove genome u odnosu na začetke ove grane, no kako je do danas velik broj studija napravljeno upravo na njima, oni su jako dobro genetički karakterizirani te su postali tradicionalni organizmi za ovakav tip istraživanja.

Drugu veliku skupinu organizama koji se koriste u znanstvenim istraživanjima čine eksperimentalne  životinje. Ovdje prioritet nije toliko generacijsko vrijeme i broj potomaka, iako je naravno to također jedan od preduvjeta. Kod ovih organizama koji se najčešće koriste u biomedicinskim istraživanjima za proučavanje odgovora na određene terapijske tretmane u smislu njihove toksičnosti i učinkovitosti, primarni uvjet jest fiziološka sličnost ispitivanih odgovora sa takvim odgovorom kod čovjeka. Kako se radi o kompleksnim biološkim procesima jasno je da kvasac ili vinska mušica ne mogu u potpunosti imitirati ove procese u čovjeka, iako danas također postoje modeli tih organizama koji se koriste i u ove svrhe. Ipak za istraživanje evolucijski kompleksnijih procesa, poput primjerice imunološkog odgovora, u biomedicini se najčešće koriste životinjski modeli razrađeni na mišu ili štakoru.

William Castle

Začeci sustavnijeg korištenja ovih životinja u eksperimentalne svrhe također sežu u vrijeme onog našeg iznurenog stanovnika svijeta 1920-tih kada su Abbie Lathrop (kao samouka amaterska uzgojiteljica) i William Castle (koji je od Lathrop kupio prve miševe) zapravo utrli put uspostavi prvih laboratorijskih mišjih sojeva koji i danas čine temelj u istraživanjima kralježnjaka. Danas možemo reći kako se razvila čitava „industrija“ ovih modelnih organizama te se tako danas mogu uzgojiti životinje koje prestavljaju model za različite bolesti čovjeka, poput različitih tumora ili šećerne bolesti. Također je moguće u modelnom organizmu inaktivirati određeni gen te proučavati svu kompleksnost razvoja tako modificiranog organizma (naravno pod uvjetom da je gubitak tog gena spojiv sa životom) te zatim dobivene spoznaje prenijeti na istraživanja ovih procesa kod ljudi.

Iako bi se možda činilo logičnim, primati se kao modelni organizmi koriste iznimno rijetko i isključivo u istraživanjima koja obuhvaćaju procese koje nije moguće drugačije ispitati, primjerice u neuroznanosti ili u slučajevima kada modeli poput mišjeg ne predstavljaju dobru aproksimaciju procesa u fiziologiji čovjeka. Razloga tome ima više, od etičkih, do financijskih i tehničkih a i činjenice da primati imaju duži životni vijek te relativno slabu reproduktivnu moć u odnosu na prije navedene organizme.¹²

Naravno, prema svim životinjama korištenim u eksperimentalne svrhe danas se postupa prema najvišim etičkim standardima te se njihov broj svodi na najmanju opravdanu mjeru, no moramo biti realni i priznati kako u nekim segmentima istraživanja još uvijek ne postoje zadovoljavajući in vitro modeli koji bi mogli u potpunosti zamijeniti korištenje eksperimentalnih životinja.  Stoga kad pročitate neki članak o revolucionarnom otkriću u području biomedicine obratite pažnju i na to na kojem su modelu provedena istraživanja jer tim živim bićima smo veliki dužnici.

Karakteristike nekih modelnih organizama koji se najčešće koriste u istraživanjima:
Vinska mušica (Drosophila melanogaster)

• Jedan od najviše i najduže korištenih modelnih organizama
• Ženke žive do mjesec dana na sobnoj temperaturi što se može produžiti i do dva mjeseca pri nižim temperaturama
• Ženske jedinke se na temelju vanjskih karakteristika lako razlikuju od muških
• Kratak reprodukcijski cikus od 8-14 dana
• Jednostavne i jeftine za uzgoj
• Genom sekvenciran 2000. godine
• 75% gena koji su kod čovjeka povezani s razvojem različitih bolesti prisutno je i kod vinske mušice
• postoji dobro dokumentirana baza o njihovoj genetici

Oblić (Caenorhabditis elegans)

• Genom sadrži oko 20 000 gena kao i genom čovjeka i molekularni signalni putevi imaju sličnosti
• Stvara preko 1000 spolnih stanica dnevno
• Životni ciklus od 2 tjedna
• Proziran pokrov tijela omogućuje praćenje pojedinih stanica tijekom razvojnih stadija pod mikroskopom, a tijelo ima mali broj stanica, oko 1000
• Ima živčane, mišićne i probavne stanice ali nema skelet i krvožilni sustav
• Lako stvaranje mutanata pojedinih gena kako bi se istraživala njihova funkcija a geni imaju svoje pandane također u genomu čovjeka te se C.elegans koristi u istraživanjima nekih neuroloških bolesti, prirođenih bolesti srca i bubrega, te tumorskih bolesti i procesa uključenih u starenje organizma a mogu poslužiti i za isptivanje učinka supstanci s potencijalnom terapijskom primjenom.

Zebrica (Danio rerio)

• tropska ribica veličine nekoliko centimetara, prozirna u ranim razvojnim stadijima
• Kako se radi o kralježnjaku, postoji sličnost u tkivima i organima s drugim kralježnjacima pa tako i čovjekom
• Genom sekvenciran i objavljen 2013. godine i oko 70% gena je zajedničko s genima čovjeka dok oko 84% gena povezanih s bolestima čovjeka ima svoj pandan u genomu zebrice
• Relativno jednostavno stvaranje mutanata za pojedini gen
• Jeftinija za uzgoj u odnosu na miševe
• Stvara na stotine potomaka u tjednom ritmu,  vantjelesna oplodnja omogućava istraživanje ranih faza razvoja embrija
• Brzi rast i razvoj, primjerice u jednom danu embrij zebrice prođe kroz razvojne faze koje u razvoju embrija čovjeka traju i do mjesec dana
• Specifična sposobnost regeneracije srčanog mišića koja je od intertesa i za proučavanje regeneracije srčanog mišića ljudi

Miš (Mus musculus)

• Preferencijalni model za istraživanja molekularnih procesa sisavaca
• Genom sekvenciran i objavljen 2002. godine
• Velika sličnost s čovjekom u genetici, fiziologiji i anatomiji
• Mali, lako uzgojivi, kratko generacijsko vrijeme i životni vijek
• Pogodni za istraživanja kompleksnih bolesti koje uključuju promjene u imunološkom, hormonalnom, kardiovaskularnom sustavu a koje nije moguće proučavati u nižim modelnim organizmima jer oni te sustave ili nemaju ili nisu usporedivi s ljudskim.
• Spontano obolijevaju od bolesti koje pogađaju čovjeka poput šećerne bolesti ili tumorskih bolesti,a postoji i veliki broj  različitih sojeva s dobro definiranim svojstvima.
• Dobro razvijene metode genetičke manipulacije i stvaranja modela za pojedine bolesti čovjeka

Literatura:

1) Miko, I. (2008) Gregor Mendel and the principles of inheritance. Nature Education 1(1):134 https://www.nature.com/scitable/topicpage/gregor-mendel-and-the-principles-of-inheritance-593

2) Van Norman JM, Benfey PN (2009). Arabidopsis thaliana as a Model Organism in Systems Biology. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 1(3): 372–379.

3) Blount ZD (2015). The unexhausted potential of E. coli. Elife. 25;4. doi: 10.7554/eLife.05826.

4) https://www.labome.com/method/Xenopus-laevis-as-a-Model-System.html

5) D. W. Burt (2007). Emergence of the Chicken as a Model Organism: Implications for Agriculture and Biology Poultry Science. 86(7): 1460–1471, https://doi.org/10.1093/ps/86.7.1460

6) https://www.nature.com/scitable/topicpage/thomas-hunt-morgan-the-fruit-fly-scientist-6579789

7) Hales KG, Korey CA, Larracuente AM, Roberts DM (2015) Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Genetics 201(3):815-842

8) Karathia H,Vilaprinyo E, Sorribas A, Alves R (2011) Saccharomyces cerevisiae as a Model Organism: A Comparative Study PLoS One. 6(2): e16015.  doi:10.1371/journal.pone.0016015

9) https://bigpictureeducation.com/model-organisms-genetics-research-nematode-worm

10) https://irp.nih.gov/blog/post/2016/08/why-use-zebrafish-to-study-human-diseases

11) Perlman RL (2016) Mouse models of human disease. An evolutionary perspective. Evol Med Public Health. 2016(1): 170–176. doi:  10.1093/emph/eow014

12) Garbarini N (2010). Primates as a model for research. Disease Models & Mechanisms 3: 15-19; doi: 10.1242/dmm.004861