Ciljana razgradnja proteina – novi pristup liječenju tumorskih i neurodegenerativnih bolesti

Pravi lijek, pravom oboljelom, u pravo vrijeme, krilatica je personalizirane medicine. Tamara Čačev objašnjava novi pristup u liječenju tumora i neurodegenerativnih bolesti kojim se umjesto inhibicije funkcije proteina koji ima ulogu u pokretanju i održavanju patoloških procesa, on potpuno uklanja iz stanice

Personalizirana medicina je pojam o kojem se već dugo priča a osnovna ideja je pomak od pristupa u kojem se stvaraju lijekovi i dijagnostičko/terapijski postupci koji će u najboljem slučaju „pokriti“ potrebe većine oboljelih, prema prilagođavanju liječenja specifičnim karakteristikama svakog pojedinog oboljelog. Umjesto liječenja simptoma na temelju prosjeka populacije, personalizirana medicina koristi se genetskim, molekularnim i okolišnim podatcima kako bi se proizvela i iskoristila najučinkovitija terapija uz minimalne nuspojave. Krilatica koja prati ovo područje jest: pravi lijek, pravom oboljelom, u pravo vrijeme. No, ne znam jeste li se ikad zapitali koliko su molekularne „mete“ za stvaranje potencijalnih novih lijekova česte i imamo li mi još neiscrpljenih mogućnosti za razvoj novih terapija ili smo dosegli maksimum?

Danas znamo da ljudskom organizmu postoji više od dvadeset tisuća različitih proteina (a taj se broj penje i višestruko ako uzmemo u obzir njihove modifikacije), od kojih svaki ima specifičnu strukturu i funkciju. Klasični lijekovi koji se vežu na proteine djeluju kroz male molekule koje prepoznaju tzv. aktivna ili vezna mjesta, najčešće u obliku džepova ili utora na površini proteina gdje se odvijaju enzimatske reakcije ili gdje protein komunicira s drugim molekulama. Međutim, procjenjuje se da samo mali broj ljudskih proteina ima takve jasno definirane, farmakološki pristupačne džepove, što znači da većina proteoma ostaje izvan dosega konvencionalnih lijekova. Također, farmakologija se več  desetljećima oslanja na klasične lijekove koji djeluju prvenstveno kroz inhibiciju funkcije proteina. Takvi pristupi, iako iznimno uspješni u određenim kontekstima, imaju značajna ograničenja. Procjenjuje se da samo od petnaest do dvadeset posto proteina u ljudskom organizmu ima strukturalna mjesta pogodna za direktnu vezu takvih malih molekula, što znači da veliki dio proteoma ostaje farmakološki nedostupan. Drugim riječima, postoje proteini koji su patološki ključni, ali ih klasične terapije ne mogu učinkovito ciljati.

Ova problematika posebno dolazi do izražaja u stvaranju novih lijekova za tumorske i neurodegenerativne bolesti, gdje određeni proteini igraju presudnu ulogu u pokretanju i održavanju patoloških procesa. U tumorima, transkripcijski faktori, receptori i proteinski kompleksi reguliraju ekspresiju gena koji kontroliraju proliferaciju, preživljavanje stanica i sposobnost izbjegavanja imunološkog nadzora, čineći ih ključnim pokretačima rasta tumora. Slična složenost postoji i kod neurodegenerativnih bolesti, u kojima agregirani proteini poput proteina tau, alfa-sinukleina ili mutantnog huntingtina formiraju toksične agregate unutar neurona i oštećuju signalne puteve, što dovodi do postupnog gubitka funkcije i smrti stanica. Ovi proteini često nemaju očite vezne površine ili se pojavljuju u obliku kompleksa i agregata koji ih čine nedostupnima za direktni pristup potencijalnih molekula inhibitora. Tradicionalni farmakološki pristupi koji se oslanjaju na inhibiciju enzimske aktivnosti ili vezanje malih molekula za aktivna mjesta proteina, često su ovdje neučinkoviti jer ti proteini nemaju pristupačne vezne džepove, mijenjaju konformaciju ili djeluju unutar većih kompleksa, zbog čega su dugo bili označeni kao „undruggable“. Posljedica toga je da klasični lijekovi ne mogu učinkovito zaustaviti ključne patološke procese što naglašava potrebu za novim inovativnim pristupima. Jedan od takvih iskoraka koji je pobudio veliki interes u znanstvenoj literaturi u nekoliko proteklih godina jest ciljana razgradnja proteina (engl. targeted protein degradation) gdje se kreće od sasvim druge ideje, a to je da se protein koji se ne može farmakološki tretirati u klasičnom smislu po prije opisanoj paradigmi, naprosto ukloni iz stanice.

Ovaj pristup koristi puteve degradacije proteina koji su već prisutni u stanici, prvenstveno ubikvitin-proteasomski sustav, kako bi se ciljani protein označio za uništenje, čime se on trajno uklanja iz stanice. Ubikvitin-proteasomski sustav djeluje kao unutarnji „odred za čišćenje“ stanice. Proteini koji su stari, oštećeni ili pogrešne trodimenzionalne strukture, označavaju se molekulom ubikvitina, malim proteinom od 76 aminokiselina, koji se kovalentno veže na protein pomoću niza enzima. Aktivacija ubikvitina započinje enzimom E1, slijedi njegov transport i prijenos preko E2 konjugacijskog enzima, dok E3 ligaza prepoznaje specifične ciljne proteine i katalizira dodavanje ubikvitinskog lanca. Kada protein nosi dovoljno ubikvitinskih oznaka, prepoznaje ga proteasom, velika proteolitička struktura unutar stanice koja cijepa protein u peptide i tako ga uništava (slika 1). Ubiquitin-proteasomski sustav iznimno je složen, vremenski strogo reguliran i evolucijski očuvan stanični put koji ima ključnu ulogu u velikom broju staničnih funkcija. Od stanične diferencijacije do stanične smrti, u velikoj mjeri određuje sudbinu stanica i proteina. Razumijevanje ovog sustava iznimno je važno jer poremećaji u ovom putu često upućuju na patogenezu mnogih bolesti.

Slika 1. Ubikvitin-proteasomski sustav (Preuzeto s https://lifesensors.com/ubiquitinproteasomesystem/)

Ciljana degradacija proteina iskorištava ovaj sustav kako bi ciljani protein eliminirala iz stanice a da se pritom ne oštete ostale funkcije stanice. Najpoznatija i najrazvijenija strategija ciljane degradacije proteina temelji se na tzv. PROTAC molekulama. PROTAC, što je skraćenica za PROteolysis Targeting Chimera, je bifunkcionalna molekula koja sadrži dva liganda, jedan ligand za ciljani protein i drugi za E3 ligazu koji su međusoobno povezani kemijskom spojnicom, tzv. linkerom. Kada PROTAC istovremeno veže ciljani protein i E3 ligazu, formira se kompleks u kojem E3 ligaza katalizira dodavanje ubiquitina na protein, označavajući ga za degradaciju. Nakon što proteasom razgradi protein, PROTAC molekula ostaje netaknuta i može ponovno inicirati proces s novom molekulom proteina (Slika 2a). Ovakav katalitički mehanizam znači da jedna molekula PROTAC-a može uputiti na razgradnju više molekula proteina, čime se značajno smanjuje potrebna doza i potencijalna toksičnost u odnosu na klasične inhibitore. Za razliku od klasičnih lijekova koji moraju kontinuirano blokirati vezno mjesto proteina, molekuli PROTAC dovoljan je kratki kontakt da označi protein za uništenje.

Slika 2. Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) i molecular glue degrader (MGD) dvije klasične strategije ciljane razgradnje proteina koje induciraju ili pojačavaju interakciju između E3 ubikvitin-ligaze i ciljnog proteina (protein od interesa, POI) kako bi potaknuli prijenos ubikvitina i posljedičnu proteasomsku degradaciju. Slika preuzeta iz Hinterndorfer M, Spiteri VA, Ciulli A, Winter GE. Targeted protein degradation for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2025;25(7):450–467. doi:10.1038/s41568 025 00817 8.

Uz molekule PROTAC, postoje i molekule koje se u engleskoj literaturi nazivaju „molecular glue degrader“ (MDG), i iskreno, teško bi mi bilo smisliti ispravni hrvatski naziv koji bi u malo riječi objasnio bit. Stoga ću reći kako se radi o malim ligandima koji stabiliziraju interakciju između ciljanog proteina i E3 ligaze bez potrebe za bifunkcionalnom strukturom koja je prisutna u prethodnom pristupu. Oni u molekularnom smislu djeluju kao ljepilo koje lijepi protein i ligazu zajedno, omogućujući ubikvitinilaciju i degradaciju ciljnog proteina (slika 2b). Derivati poput talidomida, koji djeluju kroz E3 ligazu, klasični su primjeri koji su pokazali kako stabilizacija prirodnih interakcija može biti terapijski korisna, što je i pokazano na primjeru multiplog mijeloma. Inače, talidomid kao spoj koji se koristi u farmaceutskoj primjeni ima izrazito negativnu reputaciju (1957., primjena u trudnica koja je rezultirala malformacijama djece), no korištenjem u nekim novim indikacijama pokazuje se kako od njega još može biti i značajne koristi.

Ciljana degradacija proteina nije ograničena samo na proteosomski put degradacije unutar stanice. Noviji pristupi, poput LYTAC, AUTAC i ATTEC, omogućuju degradaciju proteina koji su membranski ili izvan stanice, kao i aktivaciju autofagije. LYTAC molekule koriste receptore endocitoze kako bi usmjerile izvanstanične proteine u lizosome, dok AUTAC i ATTEC aktiviraju autofagijski put za uklanjanje toksičnih proteina ili agregata. Takvi pristupi posebno su relevantni za neurodegenerativne bolesti, gdje proteini često formiraju agregate koje stanica ne može sama učinkovito razgraditi.

U onkologiji, ciljana degradacija proteina već daje prve rezultate. U znanstvenoj literaturi opisan je primjer temeljen na androgenom receptoru u hormonski ovisnom raku prostate.  Radi se o klasičnoj meti inhibitora koji se danas primjenjuju u liječenju, no mutacije i alternativne izoforme često dovode do rezistencije na terapiju. U životonjskom modelu je pokazano kako PROTAC molekule dizajnirane tako da ciljaju androgeni receptor omogućuju njegovu potpunu degradaciju, smanjujući proliferaciju tumorskih stanica i odgađajući razvoj rezistencije. Ovo nas dovodi do potencijala degradacije receptora kao potencijalno superiornijeg terapijskog mehanizma u odnosu na konvencionalnu inhibiciju. Slični rezultati pokazani su kod estrogenskih receptora u karcinomu dojke, gdje PROTAC-i učinkovito uklanjaju receptor i smanjuju ekspresiju gena povezanih s aktivacijom estrogenskih receptora, pružajući veću supresiju tumorskih signala od konvencionalnih inhibitora.

U tumorima su česte aktivirajuće mutacije proteina KRAS koje dovode do njegove trajne aktivacije. Posljedično dolazi do trajne stimulacije proliferacijskih i antiapoptotskih signalnih putova u kojima ovaj protein sudjeluje, neovisno o signalima receptora rasta koji se nalaze „uzvodno“ u procesu okidanja signala. Mutacije KRAS-a posebno su česte karcinomima debelog crijeva i adenokarcinomima pluća, gdje djeluju kao u ranim fazama tumorigeneze i doprinose progresiji tumora, metaboličkoj reprogramaciji i otpornosti na terapiju. KRAS dugo nije bio pogodan terapijski cilj jer nema izražene vezne džepove za male molekule, a istodobno veže molekulu GTP (njegov glavni okidač) s vrlo visokim afinitetom, što otežava razvoj kompetitivnih inhibitora. Dodatno, onkogene mutacije stabiliziraju aktivni GTP-vezani oblik proteina i uzrokuju trajnu aktivaciju signalnih putova rasta. Tek su nedavno razvijeni inhibitori specifični za pojedine mutacije, primjerice za KRAS G12C, ali većina KRAS mutacija i dalje je terapijski izazov. Napredak u dizajnu PROTAC molekula otvorio je mogućnost ciljanja mutacija u proteinu KRAS. Molekule PROTAC specifične za mutantne oblike KRAS smanjuju njegovu razinu u tumorskim stanicama, blokiraju proliferaciju i pokazuju selektivnost prema mutantu u odnosu na divlji tip proteina što je veliki iskorak u farmakološkom tretmanu tumora. U nizu recentnih radova objavljeni su  rezultati koji prikazuju PROTAC‑based pristupe za KRAS G12C i druge mutacije, potvrđujući potencijal degradacije kao terapeutskog mehanizma.

Poseban su izazov i neurodegenerativne bolesti jer uključuju nakupljanje patoloških proteina u neuronima što dovodi do toksičnih agregata i gubitka njihove funkcije. Alzheimerova bolest karakterizirana je nakupljanjem beta-amiloida i hiperfosforiliranog proteina tau, dok kod Parkinsonove bolesti dolazi do akumulacije alfa-sinukleina. Kod ALS i frontotemporalne demencije često se opaža TDP‑43 ili FUS agregacija. Klasični lijekovi uglavnom ublažavaju simptome i ne utječu direktno na uzrok nakupljanja proteina. Ciljana degradacija poteina bi omogućila selektivnu degradaciju tih proteina i agregata, što otvara mogućnost modifikacije progresije bolesti. U modelima Alzheimerove bolesti molekule PROTAC usmjerene na protein tau smanjuju neurofibrilarne nakupine i poboljšavaju funkciju neurona kako je to prezentirano u recentnoj literaturi. Također, pokazano je kako degradatori alfa-sinukleina u modelima Parkinsonove bolesti smanjuju toksične agregate, potencijalno usporavajući neurodegeneraciju.

Iz svega možemo zaključiti kako su prednosti ciljane degradacije proteina višestruke. Njome je omogućeno farmakološko „tretiranje“ proteina koji u klasičnim pristupima nisu mogli biti mete, pri tome se u potpunosti uklanja funkcija ciljnog proteina. Kako se molekule koje se koriste ponašaju kao svojevrsni enzimi u smislu njihove katalitičke funkcije, samim time smanjuje se potreba za velikim dozama tih spojeva koje bi potencijalno mogle biti toksične. Dodatno, ove strategije potencijalno smanjuju razvoj rezistencije, posebno u tumorima gdje mutacije često kompromitiraju učinkovitost inhibitora. Međutim, postoji niz izazova vezano uz ovaj pristup razvoju novih lijekova. PROTAC molekule su veće od standardnih malih lijekova, što otežava prolazak kroz membrane i distribuciju u tkivima, a prolazak kroz krvno-moždanu barijeru ostaje veliki izazov kod neurodegenerativnih bolesti. Selekcija odgovarajuće E3 ligaze koja je prisutna u željenom tkivu i ne izaziva neželjenu degradaciju ostalih proteina također je bitno pitanje. Osim toga, kompleksnost kemijskog dizajna, potencijal za tzv. off-target neželjne učinke kao i adaptivna reakcija stanice na degradaciju proteina predstavljaju dodatne prepreke. Ipak, iako su mnoge od ovih strategija još u eksperimentalnoj fazi, njihova biološka osnova i rani rezultati ukazuju na to da je budućnost novih terapija i u „čišćenju“ proteina iz stanice, a ne samo u blokadi njihovih funkcija.

Literatura

1) Békés M, Langley DR, Crews CM. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(3):181–200. doi:10.1038/s41573 021 00371 6.

2) Tsai JM, Nowak RP, Ebert BL, Fischer ES. Targeted protein degradation: from mechanisms to clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024;25(4):280–300. doi:10.1038/s41580 024 00729 9.

3)  Hinterndorfer M, Spiteri VA, Ciulli A, Winter GE. Targeted protein degradation for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2025;25(7):450–467. doi:10.1038/s41568 025 00817 8.

4) Chirnomas D, Hornberger KR, Crews CM. Protein degraders enter the clinic- a new approach to cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2023;20(5):345–361. doi:10.1038/s41571 023 00736 3.

5) Huang X, Zhang G, Wu Z, et al. Expanding the horizons of targeted protein degradation: A non small molecule perspective. Acta Pharm Sin B. 2024;14(1):48–68. doi:10.1016/j.apsb.2024.01.010.

6)  Recent PROTAC KRAS targeted approaches in preclinical models. Nat Rev Drug Discov. 2024;23(6):440–459.

7) Autophagy Targeting Chimeras (AUTAC) for aggregated proteins. Chem Rev. 2024;124(2):1123–1145.

8) Synthetic approaches for Lysosome Targeting Chimeras (LYTAC). Nat Chem Biol. 2025;21:200–214.