Otvaranje vrata razvoju terapija protiv autoimunih bolesti i tumora.

Nobelove nagrade za medicinu i fiziologiju 2025. godine dobili su Mary E. Brunkow, Fred Ramsdell i Shimon Sakaguchi za istraživanja mehanizama periferne imunotolerancije. Njihova su otkrića, objašnjava Tamara Čačev, otvorila put razvoju novih terapijskih pristupa koji bi mogli omogućiti liječenje ili čak izlječenje autoimunih bolesti, poboljšati učinkovitost onkoloških terapija te spriječiti ozbiljne komplikacije nakon transplantacije.

• Naslovna fotografija: Mary E. Brunkow, Frederick J. Ramsdell i Shimon Sakaguchi. (Ill. Niklas Elmehed © Nobel Prize Outreach)

• Dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković. Čačev je također članica Savjeta Ideje.hr

Kada govorimo o različitim organskim sustavima u našem organizmu svima je jasno čemu služi i kako funkcionira probavni ili spolni sustav. Većini ljudi je jasno čemu služi i imunološki sustav, ali problem nastaje kad treba objasniti kako djeluje i o kojim se organima i tkivima radi. Nije to čudno budući da se radi o izuzetno kompleksnom sustavu te još kompleksnijim mehanizmima regulacije pa je stoga imunologija svakako jedna od najtežih grana medicine i biologije od koje zaziru i oni koji su to studirali. Priznat ću da i ja imam veliko strahopoštovanje prema ekspertima u tom kraljevskom području. Kako su ovogodišnje Nobelove nagrade za medicinu ili fiziologiju dodijeljene za otkrića za koja je, da bi ih se moglo razumjeti, potrebno puno prethodnog specifičnog znanja, u ovom ću tekstu prikazati samo temeljne ideje i konzekvence ovih otkrića.

Prije nego dublje zađem u temu valja ponoviti osnove. Nakon infekcije našeg organizma neposredni odgovor je urođeni imunološki odgovor, dok je adaptivnom-stečenom imunološkom odgovoru potrebno nekoliko dana da se aktivira. Obilježje adaptivnog imunološkog sustava jest njegova sposobnost da „pamti“ patogene kojima je tijelo ranije bilo izloženo, što omogućuje bržu i učinkovitiju reakciju pri sljedećem susretu s istim uzročnikom. No, jeste  li se ikad zapitali kako naš imunološki sustav prepozna viruse i bakterije makar ih nikad prije nije „vidio“ i zašto nas većina ipak ne razvija alergije na sve što nas okružuje ili što unosimo hranom? Jedna je od najfascinantnijih značajki imunološkog sustava njegova sposobnost da istovremeno štiti organizam od vanjskih prijetnji i sprječava razarajuće napade na vlastite stanice i tkiva. Ta ravnoteža održava se kroz fenomen koji nazivamo imunotolerancija. Pod pojmom antigena podrazumijevamo molekule koje potiču stvaranje antitijela, odnosno imunološku reakciju u organizmu. Imunotolerancija označava stanje u kojem imunološki sustav ne reagira na određene antigene. Ti antigeni mogu biti generirani u samom organizmu ili dolaziti iz njegova okoliša. Imunotolerancija nije statična već je u konstantnoj  dinamičkoj  ravnoteži između prepoznavanja, reakcije i supresije. Održavanje te ravnoteže ključno je za zdravlje, a njezin gubitak dovodi do širokog spektra bolesti. Kada ne bi postojala imunotolerancija, svaki nepoznati antigen bio bi crvena krpa našem imunološkom sustavu što bi rezultiralo kroničnim upalama ili autoimunim reakcijama.

Prvotno se smatralo da imunotolerancija djeluje preko centralnog mehanizma koji se razvija tijekom sazrijevanja limfocita u primarnim limfoidnim organima (timus i koštana srž). U tom procesu T-limfociti, koji snažno prepoznaju vlastite antigene bivaju eliminirani (negativna selekcija); B-limfociti prolaze sličan proces u koštanoj srži. Tako organizam uklanja “opasne” klonove prije nego što dospiju u ostatak organizma, u takozvanu periferiju. Za opis tog mehanizma dodijeljena je Nobelova nagrada za medicinu ili fiziologiju 1960. godine.

Prikaz mehanizma centralne imunotolerancije. (© Nobel Prize Outreach)

S vremenom su istraživanja pokazala kako taj mehanizam nije dovoljan te se polako iskristalizirao i mehanizam periferne tolerancije. Ustanovljeno je da čak i nakon centralne selekcije određeni autoreaktivni limfociti ipak prežive. U perifernim tkivima i limfnim čvorovima njihovo djelovanje se tada prepoznaje i eliminira kroz mehanizme periferne imunotolerancije, za čije su istraživanje troje znanstvenika – Mary E. Brunkow, Fred Ramsdell i Shimon Sakaguchi, Nobelovu nagradu dobili ove godine.

Japanski imunolog Sakaguchi napravio je prvi korak u osvjetljavanju tog mehanizma kada je 1995. godine  otkrio dotad nepoznatu klasu imunoloških stanica koje štite organizam od autoimunih bolesti. Sljedeći veliki korak dogodio se 2001. godine kada su Mary Brunkow i Fred Ramsdell istražujući zašto je jedan specifičan soj miševa posebno podložan autoimunim bolestima, otkrili mutaciju u genu koji su nazvali Foxp3. Potom su dokazali da mutacije u ljudskom ekvivalentu tog gena uzrokuju rijetki autoimuni sindrom imunodisregulacije, poliglandularne endokrinopatije i enteropatije, vezan uz X kromosom (engl. IPEX, Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked). U samom nazivu sindroma opisane su njegove specifičnosti. Imunodisregulacija znači da imunološki odgovor više nije reguliran, a u ovom slučaju nije u stanju održavati toleranciju prema vlastitim tkivima. Poliglandularna endokrinopatija označava višestruke poremećaje u funkciji endokrinih žlijezda (npr. dijabetes tipa 1, autoimuni tireoiditis). Enteropatija u ovom sindromu je povezana s teškim kroničnim proljevima i upalom crijeva zbog autoimunog oštećenja. I konačno, vezanost uz kromosom X znači da postoji genetički uzrok, mutacija gena na kromosomu X te stoga bolest pogađa uglavnom dječake dok su majke prenositelji mutacije, kako se kasnije ispostavilo u genu Foxp3. Na temelju ovog otkrića Sakaguchi je dokazao da gen Foxp3 upravlja razvojem stanica koje je on identificirao 1995. godine. Te stanice danas nazivamo regulatorne T stanice (Treg). To je ukratko kronologija događanja koja je dovela do ovogodišnje Nobelove nagrade.

Da bismo pojasnili ulogu ovih stanica najprije moramo krenuti od samih T limfocita (T stanica) koji predstavljaju jednu od središnjih komponenti adaptivnog imunološkog sustava. Njihova posebnost proizlazi iz sposobnosti prepoznavanja antigena pomoću T-staničnog receptora (TCR), što omogućuje visoko specifičan odgovor na gotovo neograničen broj različitih patogena. Za razliku od stanica urođenog imunosnog sustava, koje reagiraju brzo, ali nespecifično, T limfociti osiguravaju ciljani, memorijski i dugotrajan oblik imunološke zaštite. Nastaju u koštanoj srži, a sazrijevaju u timusu, organu po kojemu su i dobili ime. Tijekom sazrijevanja prolaze procese pozitivne i negativne selekcije kojima se osigurava da u periferni krvotok izlaze stanice sposobne razlikovati vlastite od stranih struktura, čime se održava temeljna imunološka tolerancija.

U funkcionalnom smislu T limfociti čine heterogenu populaciju s jasno definiranim ulogama. Pomagački T limfociti koordiniraju imunološki odgovor aktivacijom B limfocita, citotoksičnih T limfocita i makrofaga, te lučenjem citokina usmjeravaju tip odgovora (npr. Th1, Th2, Th17); citotoksični T limfociti ciljano uništavaju stanice zaražene virusima ili transformirane tumorske stanice; regulatorni T limfociti (Treg) održavaju imunološku homeostazu i sprečavaju razvoj autoimunih bolesti supresijom pretjerane aktivacije, dok memorijski T limfociti omogućuju brzu i snažnu reakciju pri ponovnom susretu s istim antigenom. Na taj način T limfociti ne djeluju izolirano, već u suradnji s drugim stanicama imunološkog sustava, poput B limfocita, dendritičnih stanica i stanica prirođenog imuniteta. Kako bi razlikovali različite vrste T stanica, identificiramo ih po specifičnim  proteinima na njihovoj površini. Pomagačke T stanice prepoznaju se po proteinu nazvanom CD4, dok se citotoksične T stanice prepoznaju po prisutnosti proteina CD8. Naravno, ovakvih karakterizacija stanica s obzirom na površinske proteine s vremenom je bivalo sve više budući da je otkriveno i niz podtipova sa specifičnim funkcijama.

Rekli smo da T stanice na svojoj površini nose posebne proteine zvane T-stanični receptori. Ti receptori mogu se usporediti sa svojevrsnim senzorima. Njima T stanice „pregledavaju“ druge stanice kako bi otkrile nalazi li se organizam pod napadom. Posebnost T-staničnih receptora je u tome što nastaju nasumičnim kombiniranjem brojnih gena, što u teoriji omogućuje stvaranje više od 10¹⁵ T-staničnih receptora različite strukture. Upravo u toj velikoj diverzifikaciji leži njihova snaga da prepoznaju najrazličitije antigene. Naime, u našem organizmu postoje T stanice s najrazličitijim varijantama T-staničnih receptora i to već prije nego li su uopće susrele antigen koji treba prepoznati. Stoga je moguće da se naš imunološki sustav aktiviraju i virusi koje nikad prije nismo susreli, no hoćemo li se obraniti već je druga priča. U tako širokoj paleti mogućih kombinacija gena i različitih „modela“ ovih receptora jasno je da će neki od njih moći prepoznati i strukture prisutne na našim vlastitim stanicama ili u hrani ili zraku koje unosimo u organizam. Ipak, naš imunološki sustav (većinom) ne reagira na takve vrste podražaja. Razlog je naravno imunotolerancija, no uz već opisanu centralnu imunotoleranciju, s vremenom se pokazalo da ipak mora postojati još neki oblik kontrole toga što se događa u ovoj vrsti interakcija.

Kako T stanice prepoznaju strani antigen, u ovom slučaju virus. Najprije inficirane stanice putem proteinskog kompleksa HLA izlože fragment virusa na svoju površinu. To prepozna neka od T-stanica čiji površinski receptor se može vezati na taj fragment. To vezanje aktivira T-stanicu te alarmira ostale stanice imunosnog sustava da priskoče u pomoć. (© Nobel Prize Outreach)

Dugo je ovo područje istraživanja išlo u smjeru koji se na kraju pokazao krivim. Sakaguchi je prvi okrenuo istraživanja u drugom smjeru. Ponovno se zaintrigirao za već poznati eksperiment u kojem je novorođenim miševima kirurški odstranjen timus. Pretpostavka prethodnog eksperimenta bila je da će takvi miševi razviti manji broj T stanica i imati oslabljen imunološki sustav. Međutim, ako bi operacija bila izvedena tri dana nakon rođenja, imunološki je sustav pretjerano reagirao i potpuno se poremetio, što je rezultiralo razvojem čitavog spektra autoimunih bolesti. Sakaguchi je modificirao taj eksperiment tako što je u miševe bez timusa injicirao T stanice koje su sazrele u genetički identičnim miševima te se u tim miševima nisu razvile autoimune bolesti.

Prikaz eksperimenta koji je proveo Sakaguchi. (© Nobel Prize Outreach)

U eksperimentu u kojem je uspio zaštititi miševe od autoimunih bolesti, Sakaguchi je koristio stanice koje su na svojoj površini imale CD4, dakle pomagačke T stanice. Uobičajeno, te stanice aktiviraju imunološki sustav i potiču ga na djelovanje, no u Sakaguchijevom eksperimentu imunološki je odgovor bio potisnut. Na temelju toga zaključio je da moraju postojati različiti podtipovi T stanica koje nose CD4, s različitim funkcijama. No, kako ih razlikovati jedne od drugih? Pitanje ga je okupiralo više od desetljeća, ali je 1995. godine konačno dokazao da  T stanice koje „smiruju“ imunološki sustav na svojoj površini nose i dodatni specifični proteinski biljeg CD25. Taj novootkriveni podtip T stanica nazvan je regulatorne T stanice.

Mehanizam periferne imunotolerancije. Ukoliko neka od T stanica prođe kroz kontrolu u timusu te prepozna neki od proteina vlastitog organizma, tada regulatorne T stanice prepoznaju tu pogrešku i smiruju tu reakciju kako se ne bi razbuktala u autoimunu bolest. (© Nobel Prize Outreach)

U početku otkriće regulatornih T stanica nije prihvaćeno aklamacijom; dio znanstvene zajednice sumnjao je u njihovo postojanje. Tek je istraživanje drugih dvoje ovogodišnjih Nobelovih laureata potvrdilo i zaokružilo Sakaguchijev rad. Mary Brunkow i Fred Ramsdell okrenuli su se također jednom povijesnom eksperimentu iz četrdesetih godina prošlog stoljeća koji je bio dio istraživanja posljedica izloženosti zračenju u okviru poznatog projekta Manhanttan. Naime, tijekom tih eksperimenata znanstvenici su dobili specifičnu liniju miševa koju je dvoje sadašnjih Nobelovaca koristilo u svojim eksperimentima. Ti su miševi uz ostalo imali jako povećanu slezenu i limfne čvorove a živjeli su samo nekoliko tjedana. Već tijekom prvotnih eksperimenata u četrdesetima istraživači su zaključili da se mutacija koja uzrokuje bolest mora nalaziti na X kromosomu jer su  mužjaci bili bolesni a ženke prenosioci, budući da imaju dvije kopije kromosoma X pa im zdravi alel nadoknađuje funkciju mutiranog gena. U eksperimentima tijekom 1990-tih pokazalo se da organe ovih miševa napadaju T stanice koje razaraju vlastita tkiva te je zaključeno kako se mora raditi o genu koji je bitan za imunološki odgovor.

Mary Brunkow i Fred Ramsdell tada su krenuli u potragu za genom odgovornim za tu pojavu. Bili su zaposleni u biotehnoškoj tvrtki Celltech Chiroscience koja se bavila razvojem lijekova protiv autoimunih bolesti. Zaintrigirao ih je ovaj soj miševa a zanimalo ih je što stoji u molekularnoj podlozi njihove autoimune reakcije. Ideja je bila da se otkrije o kojem se genu na kromosomu X radi. Naravno, kao po Murphyjevom zakonu od 20 gena koje je trebalo ispitati, tek onaj dvadeseti se pokazao punim pogotkom, odnosno genom u kojem se nalazila mutacija odgovorna za nastanak ovog specifičnog soja miševa. Iz iskustva s mladim generacijama studenata molekularne biologije znam da je, slično kao kad djeci kažete da je postojalo vrijeme prije interneta i mobitela, molekularcima vrijeme prije modernih tehnologija poput next generation sequencing izgleda otprilike kao da pričate o srednjem vijeku, a ne o stvarima od prije kojih tridesetak godina. Stoga se i odbor za dodjelu Nobelove nagrade posebno potrudio da istakne o kakvom se herojskom, dugotrajnom i mukotrpnom pothvatu radilo u vrijeme bez ovih tehnologija. Na sličan način će budućim generacijama biti nevjerojatno da su mnogi kristalografi potrošili cijeli svoj životni vijek da okarakteriziraju strukturu možda svega jednog proteina. Tko će to uopće moći pojmiti kad već danas imamo Alphafold (DeepMind AI)  koji takve probleme rješava u sat vremena. Stoga je u ovoj Nobelovoj nagradi zapravo nagrađena hrabrost da se svjesno otvori istraživanje koje će biti dugotrajno i neizvjesno, dok netko drugi možda bere figurativno voće s niskih grana.

Otkriće Brunkow i Ramsdelly pomoglo je Sakaguchiju da dokaže kako je upravo gen Foxp3 bitan za razvoj regulatornih T-stanica. (© Nobel Prize Outreach)

No vratimo se Brunkow i Ramsdellu. Gen koji su otkrili do tada nije bio opisan, no pokazivao je određenu sličnost s već opisanom grupom gena FOX koji reguliraju aktivnost drugih gena te su ga stoga nazvali Foxp3. Također su posumnjali kako bi rijetka autoimuna bolest povezana s kromosomom X (IPEX) mogla imati veze s ovim genom te su tako pronašli ljudski pandan genu Foxp3, što su i dokazali na temelju analize ovog gena u uzorcima oboljelih iz čitavog svijeta (budući da se radi o rijetkoj bolesti trebalo ih je uistinu prikupiti sa svih strana).

Otkriće je pomoglo Sakaguchiju da dokaže kako je upravo gen Foxp3 bitan za razvoj regulatornih T-stanica (okarakteriziranih specifičnim pozitivitetom na biljege CD4+CD25+FOXP3+) koje sprječavaju druge T stanice da napadaju vlastita tkiva.  Također osiguravaju da se imunološki sustav vrati u „normalu“ nakon provedene eliminacije antigena kako se ne bi takva reakcija pretvorila u nešto nekontrolirano i pogibeljno za organizam (što se ipak u određenim situacijama nažalost može dogoditi).

No, zašto su ova otkrića vrjednija od nekih drugih i zaslužuju Nobelovu nagradu. Uvijek se radi o dalekosežnosti značaja koje neko otkriće povlači za sobom. Ova su otkrića otvorila put razvoju novih terapijskih pristupa koji bi mogli omogućiti liječenje ili čak izlječenje autoimunih bolesti, poboljšati učinkovitost onkoloških terapija te spriječiti ozbiljne komplikacije nakon transplantacije.

Danas znamo da tumori nizom mehanizama nastoje izbjeći da ih imunološki sustav prepozna. Tako na sebe „privlače“ brojne regulatorne T stanice kako bi se njima skrili od napada imunološkog sustava. Cilj novih antitumorskih terapija bio bi, kroz razumijevanje prethodno opisanih mehanizama, razviti takvu terapiju koja će razbiti ovaj zid regulatornih T stanica oko tumora. U slučaju autoimunih bolesti cilj je suprotan, želimo da se potakne stvaranje velikog broja regulatornih T stanica kako bi se suprimirala autoimuna reakcija. Ova ideja korisna je i za lijekove kojima bi se spriječilo odbacivanje transplantiranih organa. Alternativno se takav odgovor potencijalno može spriječiti i kultiviranjem vlastitih regulatornih T stanica oboljelog, po potrebi i njihovo modificiranje kako bi ih se usmjerilo točno na transplantirani organ, te zatim njihovo vraćanje u organizam. Ideja ovog pristupa je da tako osoba dobije veći broj vlastitih regulatornih T stanica koje bi zaštitile transplantirani organ od imunološke reakcije. Jasno je kako su ova otkrića otvorila vrata istraživanjima u mnogim za čovjeka bitnim medicinskim sferama te iznalaženju novih terapija na nekoliko različitih fronti.

• Znanstveni radovi za koje je dodijeljena Nobelova nagrada

1) Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor a-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 1995:155:1151-1164.

2) Brunkow ME, Jeffery EW, Hjerrild KA, Paeper B, Clark LB, Yasayko SA, Wilkinson JE, Galas D, Ziegler SF, Ramsdell F. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nat Genet. 2001:27:68-73.

3) Wildin RS, Ramsdell F, Peake J, Faravelli F, Casanova JL, Buist N, Levy-Lahad E, Mazzella M, Goulet O, Perroni L, Bricarelli FD, Byrne G, McEuen M, Proll S, Appleby M, Brunkow M. X-linked neonatal diabetes mellitus, enteropathy and endocrinopathy syndrome is the human equivalent of mouse scurfy. Nat Genet. 2001:27:18-20.

4) Benne; CL, Christie J, Ramsdell F, Brunkow ME, Ferguson PJ, Whitesell L, Kelly TE, Saulsbury FT, Chance PF, Ochs HD. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet. 2001:27:20-21.

5) Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 2003:299:1057-1061.