Rastaviti stanicu, a zatim sastaviti nešto novo, kao lego: možda stvorimo svijetleće biljke i mikroorganizme za čišćenje

Ideja inženjerskog pristupa biologiji je da se sekvenca DNA zapravo kodira analogno računalnom programiranju kako bi se dobile željene funkcije nekog organizma. Cilj je dobiti „genske krugove“ koji će unutar žive stanice ostvarivati neke funkcije koje ta stanica prethodno nije imala. U čemu se razlikuju sintetička biologija i genetsko inženjerstvo? Ima li (re)dizajn i (re)kodiranje čitavih genoma potencijal za stvaranje sasvim novih oganizama?

• Na naslovnoj slici prva sintetska bakterija Mycoplasmae laboratorium

Jedna od brojnih definicija sintetičke biologije jest da je to interdisciplinarno znanstveno područje koje se bavi dizajniranjem, konstruiranjem i karakterizacijom poboljšanih ili potpuno novih bioloških sustava. Radi se o nečem što se često slikovito naziva „inženjerskim pristupom“ biologiji u kojem možemo molekulu DNA usporediti sa softwareom a stanicu sa hardwareom života. Ovakav pristup ima za cilj rastaviti funkcioniranje žive stanice (zasad većinom mikroorganizama) na osnovne biološke procese te zatim dobiveno znanje iskoristiti za sastavljanje sasvim novih stanica sa specifičnim funkcijama koje bi mogle biti programabilne.

Kolika su očekivanja najviše govori da SAD ulaže u ovo područje više od 1 milijarde dolara od 2005.g. i to samo iz državnog sektora, dok su tvrtke u „synbio“ sektoru zabilježile investicije od oko 500 milijuna dolara samo u prvoj polovini 2017

Očekuje se da će sintetička biologija dati nove iskorake u poljoprivredi, sintezi različitih spojeva za farmaceutsku industriju, pretvaranja stanica mikroorganizama u dijagnostičke senzore, generiranju novih vrsta biogoriva kao i u pronalaženju rješenja za bioremedijaciju kroz stvaranje mikroorganizama koji će se koristiti za  čišćenje kontaminacije tla i voda ali i možda i svjetleće biljke. Kolika su očekivanja najviše govori podatak o tome koliko SAD kao predvodnica ovih istraživanja ulaže u ovo područje, a radi o više od 1 milijarde dolara od 2005.g. i to samo iz državnog sektora, dok su tvrtke u „synbio“ sektoru zabilježile investicije od oko 500 milijuna dolara samo u prvoj polovini 2017. ¹

Veliki zamah ovoj grani dala su znanja u području sekvenciranja genoma različitih organizama te identifikacija gena i njihove funkcije kako u pojedinom organizmu, tako i u drugim organizmima kroz evolucijsko srodstvo čime se zapravo može pratiti kako su se neki „genski krugovi“ koji omogućuju neku biološku funkciju (od engl. gene circuits  što je opet terminologija preuzeta iz tehničkih struka) razvijali tijekom evolucije.

Jedno je čitanje zapisa postojećih knjiga života u molekulama DNA organizama koji postoje u prirodi, dok je drugi proces pisanje nove knjige, koristeći riječi iz knjiga koje smo pročitali

No, nije lako „programirati stanice“ jer su znanje i tehnologija za to još uvijek nepotpuni. Kako bi se takvi „genski krugovi“ mogli uopće konstruirati de novo, u tehničkom smislu trebalo je prvo riješiti sintezu relativno dugih sekvenci DNA, što je također uspjeh novijeg datuma. Iako se radi o istoj sekvenci DNA, pročitati njezin zapis iz genoma nekog organizma i sintetizirati taj isti slijed u novoj molekuli DNA su tehnički sasvim različite stvari. Jedno je čitanje zapisa postojećih knjiga života u molekulama DNA organizama koji postoje u prirodi, dok je drugi proces pisanje novog zapisa, nove knjige, koristeći riječi iz knjiga koje smo pročitali. Interesantno jest da je jedan od pionira „čitanja“ genoma čovjeka Craig Venter, danas također jedan od najznačajnih pokretača upravo sintetičke biologije odnosno stvaranja novih  funkcionalnih zapisa u DNA.

Craig Venter, jedan od najznačajnih pokretača upravo sintetičke biologije odnosno stvaranja novih  funkcionalnih zapisa u DNA

Ideja inženjerskog pristupa biologiji je da se sekvenca DNA koju određuju 4 nukleotidne baze A, T, G, C zapravo kodira analogno računalnom programiranju kako bi se dobile željene funkcije nekog organizma. Cilj je takvim kodiranjem dobiti  „genske krugove“  koji će unutar žive stanice ostvarivati neke funkcije koje ta stanica prethodno nije imala. To možemo usporediti s lego kockicama od kojih se kroz kodiranje pojedinih funkcionalnih krugova može izgraditi „minimalni“ genom organizma koji će ih biti u stanju izvršavati.

Takve „genske krugove“ doslovno možemo, ukoliko znamo što radimo, napisati koristeći univerzalni genetički kod A-T-G-C što je svakako najteži put jer još nismo na toj razini poznavanja genoma. Alternativno možemo prezeti sekvence DNA koje kodiraju te funkcije u nekom drugom organizmu iz neke od postojećih baza podataka što je svakako malo jednostavniji pristup. U novije vrijeme postoje i open source baze sa već iskodiranim cijelim sklopovima sekvenci koji se mogu iskoristiti za neke daljnje modifikacije. Drugačije se to zorno može predočiti i usporedbom s programiranjem „aplikacija“  poput onih na pametnim telefonima, koje se kodiraju u DNA kako bi stanica dobila nove funkcije koje im ta aplikacija nudi.

Ilustracija genskih krugova i programiranja staničnih funkcija preuzeta iz Wang B, Buck M. (2012) Customizing cell signaling using engineered genetic logic circuits. Trends in Microbiology 20(8):376-384

Sistem i sinteza

Često uz pojam sintetičke biologije dolazi i pojam sistemska biologija koji se odnosi na izučavanje sveukupnih bioloških procesa na razini genoma ili proteoma u nekom živom biću metodama visoke propusnosti kojima je tek relativno nedavno postalo moguće analizirati istovremeno veliki broj gena, proteina pa čak i metabolita koji su prisutni i aktivni u nekom organizmu.

Zašto te dvije biologije idu ruku pod ruku? Iz prethodnih definicija jasno je da sistemska biologija nastoji razotkriti sve gene, odnosno proteine, uključene u funkcioniranje nekog biološkog procesa, dok sintetička biologija koristi te spoznaje, uzima iz tih informacija minimalni neophodni broj gena koji su potrebni da se neka biološka funkcija i dalje odvija učinkovito. Zatim se  takvi umjetno generirani genski krugovi ugrađuju u stanice koje te funkcije u prirodnom okruženju nikad nisu imale.

Sintetička biologija i genetičko inženjerstvo nisu ista područja. Kod genetičkog inženjerstva modificiraju se postojeće stanice na način da se u njih unese pojedinačni gen iz nekog drugog organizma, dok se ovdje radi o unosu čitavih genskih sklopova (danas se radi i sa genskim krugovima od 3-15 gena) koji tek u međuodnosu daju neku biološku funkciju. Takvi krugovi imaju svojevrsnu „sposobnost proračunavanja“. Oni mogu osjetiti što se događa unutar i izvan stanice te ovisno o toj informaciji inicirati ili deaktivirati neki biološki proces u stanici

Pri tome ugrađivanju genskih krugova u stanice koristi se dosta metoda iz klasičnog genetičkog inženjerstva, no unatoč naporima još je relativno malo stvarnog inženjerskog pristupa u toj grani jer se radi o kompleksnim živim sustavima kojima nedostaje standardizacije. Još jedan od razloga zašto sintetička biologija i genetičko inženjerstvo nisu ista područja jest da se kod genetičkog inženjerstva modificiraju postojeće stanice na način da se u njih unese najčešće pojedinačni gen iz nekog drugog organizma, dok se ovdje radi o unosu čitavih genskih sklopova od par do više gena (danas se radi i sa genskim krugovima od 3-15 gena) koji tek u međuodnosu daju neku biološku funkciju. Kako bi si to lakše predočili možemo zamisliti kao da se u stanicu unose dijelovi nekog složenog stroja koji tek ako su svi dijelovi prisutni može proizvesti konačni produkt što je u ovom slučaju neka željena biološka funkcija koju stanica nije imala prije takvog tretmana. Ono što također čini razliku između genetičkog inženjerstva s transferom jednog gena u odnosu na sintetičku biologiju gdje se u stanicu unose cijeli genski krugovi jest i da takvi krugovi imaju svojevrsnu „sposobnost proračunavanja“. Oni mogu osjetiti što se događa unutar i izvan stanice –npr. razinu nekog proteina, ili mRNA u stanici te zatim ovisno o toj informaciji inicirati ili deaktivirati neki biološki proces u stanici.

Osim uspostavljanja osnovnih genskih krugova za neku biološku funkciju koja postoji u prirodi a mi je želimo uvesti u stanice koje te funkcije nemaju, recimo želimo da neki mikroorganizam sintetizira neki spoj koji dosada nije sintetizirao, još jedno područje sintetičke biologije s velikim potencijalom jest i ciljani (re)dizajn proteina kako bi im se proširio spektar funkcionalnosti u odnosu na one proteine koji su prisutni prirodno u stanicama.

Kronologija

Koja su otkrića, prekretnice i tehnologije bile presudne za razvoj sintetičke biologije od 2000. g. do danas?

Naravno da niti jedno područje znanosti ne počiva na samo nekoliko ključnih momenata već se u današnje doba radi o dugogodišnjem radu čitavih timova znanstvenika koji godinama razrađuju neke koncepte koji, kako to obično biva, u teoriji izgledaju genijalno jednostavnima, no kada ih treba provesti u eksperimentalnu praksu to često ne bude slučaj. Ipak kako živimo u vrijeme globalnog sela i kompetitivnosti sve većeg broja znanstvenika za ipak ograničenu količinu količinu ulaganja u znanost, medijski najeksponiraniji predvodnik ovog područja svakako je postao Craig Venter te njegov institut J.C. Venter Institute. To nije nezasluženo, no nije naišlo na odobravanje svih koji se bave sintetičkom biologijom jer se ipak radi o prilično ozbiljnim istraživanjima sa dalekosežnim i potencijalno snažnim utjecajem na život na Zemlji. U tablici su prikazani neki značajni, osobito medijski popračeni trenuci ovog područja.

2000.	Dvije grupe znanstvenika iz SAD objavile su u časopisu Nature stvaranje prvog „genetičkog oscilatora“ i „genetičkog prekidača“ koji rade po uzoru na principe koji postoje u električnim krugovima.
2003.	Sintetiziran cijeli PhiX174 kromosom in vitro (Smith, Hutchinson i Venter, J.C. Venter Institute).
2004.	Izumljen novi način sinteze DNA (tzv. „multiplex sinteza“) koja je snizila cijenu sinteze dugačkih molekula DNA (Church, Harvard Medical School i Gio, University of Houston).
2006.	Konstruirana stanica kvasca s genima iz bakterije E.coli te genima biljke Artemisia annua (vrsta pelina), ukupno 10 gena iz 3 organizma, koja je mogla sintetizirati prekursor za artemisinin, spoj koji se koristi kao lijek protiv malarije, a za koji je 2015. g. Tu Youyou dobila Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu (Keasling i sur., Berkeley Center for Synthetic Biology).
2007.	Izvedena „transplantacija genoma“ iz jedne bakterije u drugu (tim znanstvenika s J.C. Venter Institute)
2008.	Stvoren prvi sintetički genom bakterije Mycoplasma  JCVI-syn1.0, što je bila tada najveća DNA struktura koju je stvorio čovjek (tim znanstvenika s J.C. Venter Institute)2
2010.	Genom bakterije Mycoplasma mycoides sintetiziran je u laboratoriju na temelju sekvence pohranjene u računalu te je takav sintetički genom transplantiran u stanicu bakterije Mycoplasma capricolum kojoj je prethodno uklonjen njen genom i ona se dalje uspješno umnažala. Nova sintetička bakterija popularno je nazvana Synthia a Craig Venter je taj uspjeh slikovito opisao kao prvi živi organizam kojem je roditelj računalo. (tim znanstvenika s J.C. Venter Institute).
2013.	Započela komercijalna fermentacija artemisinina, no danas je proizvodnja ovog spoja suočena s nizom problema od rezistencije do oscilacija u cijeni tog lijeka 3,4
2016.	Stvorena nova minimalna sintetička bakterija JCVI-syn3.0 sa svega 473 gena što je manje gena u odnosu na ijedan živući organizam. Kreiranje ove bakterije opet se temeljilo na genomu Mycoplasma mycoides iz kojeg je uklonjena sva neesencijalna DNA. Takav genom transplantiran je u Mycoplasma capricolum iz koje je uklonjen njen genom.

Prva sintetička bakterija

Zanimljivost vezana uz stvaranje prve sintetičke bakterije Mycoplasmae laboratorium jest ugradnja 4 „vodena žiga“ u genom koji su korišteni kao dokaz da je u sintetičkoj bakteriji stvarno sekvenca DNA koja je nastala u laboratoriju a ne njena vlastita DNA.² Kao takvi biljezi poslužile su kodirane poruke u obliku komadića sekvence molekule DNA, a kodiranje se temeljilo na univerzalnom genetičkom kodu koji vrijedi za sva živa bića (slika 1a). Princip tog koda je da sekvenca od 3 nukleotida u DNA kodira za 3 nukleotida u mRNA koji onda kodiraju za neku aminokiselinu u proteinu čije ime se konvencijom označava nekim od slova iz abecede. Tako korištenjem različitih tripleta baza u DNA možemo kodirati tekst koji će imati smisleni latinični zapis (slika 1b). To naravno nema nikakvog biološkoh smisla jer se kao biljeg mogao koristiti i neki drugi zapis no to je odraz principa koji je svojstven američkom načinu razmišljanja „yes we can“ ili možda čak „just because we can“.

Četiri biljega, zato što mu se prohtjelo

Što je zapisano u ta 4 biljega? Tu se Venter još jednom pokazao kao pravi medijski vizionar što mu je i opet zamjereno od onih koji su to smatrali nepotrebnim, ali činjenično jest privuklo veliki interes javnosti. U prvom biljegu bio je Html skript koji se u pregledniku prikazuje kao tekst čestitke onome tko ga je dekodirao sa linkom na e-mail da to i dokaže šaljući poruku na taj e-mail. Drugo biljeg je bio popis autora tog znanstvenog rada objavljenog u Sciencu s citatom Jamesa Joycea “To live, to err, to fall, to triumph, to recreate life out of life” (slika 2). Treći biljeg je također sadržavao imena autora sa citatom Roberta Oppenheimera “See things not as they are, but as they might be”. U četvrtom biljegu bila su imena preostalih autora s citatom Richarda Feynmana: “What I cannot build, I cannot understand”.

Slika 1. Univerzalni genetički kod, transkripcija-prijepis sekvence molekule DNA u  molekulu mRNA  koja služi kao kalup za sintezu proteina u procesu translacije.

a) Preuzeto s http://researchguides.library.vanderbilt.edu/c.php?g=69346&p=816436

b) Preuzeto s https://oerpub.github.io/epubjs-demo-book/content/m46032.xhtml

Slika 2. Kodirani zapis sekvence DNA prve sintetske bakterije u kojem je pomoću univerzalnog genetičkog koda zapisan dio imena autora rada u Sciencu i citat Jamesa Joycea. Preuzeto iz http://science.sciencemag.org/content/sci/suppl/2010/05/18/science.1190719.DC1/Gibson.SOM.pdf

Bez njih ne možemo preživjeti

Verzija sintetičke bakterije iz 2016.g. JCVI-syn3.0 sadrži genom sa 473 gena od kojih za gotovo jednu trećinu (149 gena) Venterov tim nije pronašao koja im je funkcija, no bilo je sigurno kroz prethodna testiranja da ukoliko ih bakterija ne posjeduje onda ne može preživjeti. Mnoge od tih gena s nepoznatom funkcijom možemo naći i u genomima drugih organizama pa čak i u ljudi.

Bilo bi dobro kada se više ne bi morale koristiti postojeće stanice nekog živog organizma kojima je odstranjen genom već kada bi mogli stvoriti sasvim nove sintetičke stanice. Druga mogućnost koja bi otvorila nove horizonte jest uporaba novokonstruiranih nukleotidnih baza koje ne postoje u prirodi. Tako bi se otvorio prostor za stvaranje novih vrsta aminokiselina i proteina koji ne postoje niti u jednom živom organizmu

No, usprkos fascinantnim ostvarenjima, još smo na početku sintetičke biologije i malo je, zapravo gotovo ništa stvarno primjenjivih rješenja koja daje ovo područje vidljivo u nekoj relativno bliskoj budućnosti. Puno je stvari koje se još moraju tehnički razraditi, primjerice bilo bi dobro kada se više ne bi morale koristiti postojeće stanice nekog živog organizma kojima je odstranjen genom već kada bi mogli stvoriti sasvim nove sintetičke stanice. Takav pristup je povezan sa svim problemima koji proizlaze iz kompleksnosti i još uvijek nedovoljne istraženosti procesa u živim stanicama, te problemima vezanim uz transfer sintetičkih molekula DNA u takve stanice što sve dovodi do slabe standardizacije, varijabilnosti i nepotrebne kompliciranosti takvog sustava.

Još uvijek  je prisutan problem unosa velikih genskih krugova koji mogu biti potencijalno veliki i do 150 000 pb što je veće od mogućnosti pakiranja virusa koji se koriste u istraživanjima genske terapije. Tako se u novije vrijeme sve više istraživanja okreće u smjeru tzv „cell-free“ sintetičke biologije no i takvi pristupi imaju nedostatke jer neke funkcionalnosti još uvijek nije moguće stvoriti u in vitro uvjetima.⁵ Druga bitna mogućnost koja bi otvorila nove horizonte jest uporaba novokonstruiranih nukleotidnih baza koje ne postoje u prirodi a čime bi se onda povećao broj mogućih kodirajućih tripleta u genetičkom kodu. Tako bi se otvorio prostor za stvaranje novih vrsta aminokiselina i proteina koji ne postoje niti u jednom živom organizmu, a na tom planu su upravo ove godine napravljeni značajni iskoraci. No rekodiranje genoma veličine E.coli je još uvijek relativno skupo jer se radi o iznosu od nekoliko milijuna dolara što obuhvaća sintezu DNA i sastavljanje genoma. Relativnost skupoće leži u tome da je apsolutni iznos bez sumnje prilično visok, no treba imati u vidu i potencijalne dobitke koji bi bili ostvareni ako bi se uspostavio neki biotehnološki postupak koji bi donio velike industrijske, farmaceutske ili poljoprivredne benefite.⁶

Mnogo se govori o prekrajanju genoma tehnologijom CRISPR-Cas9, trenutno se smatra kako će ta tehnologija biti povoljniji način kako pristupiti razvoju genskih terapija u kojima je potrebno intervenirati u manji broj gena i raditi manje opsežne zahvate na genomu. No, (re)dizajn i (re)kodiranje čitavih genoma, jednoga dana kada i ako se prevladaju tehničke poteškoće, ima potencijal za ostvarivanje puno većih izmjena genoma te stvaranja sasvim novih oganizama. Stoga je moguće da će upravo proboji na području sintetičke biologije biti oni koji će dugoročno ostvariti veći trag na našu civilizaciju i prirodu koja nas okružuje.^7,8

• dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković

Reference i dodatni linkovi:

1) U.S. National Research Council (2013) Positioning synthetic biology to meet the challenges of the 21st century. Summary report of a six Academies symposium series.

2) Gibson DG i sur. (2010) Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome. Science. 329 (5987): 52–56. doi: 10.1126/science.1190719

3) Peplow M (2013)  Malaria drug made in yeast causes market ferment. Synthetic biology delivers combination therapies into an uncertain market. Nature 494 (7436) http://www.nature.com/news/malaria-drug-made-in-yeast-causes-market-ferment-1.12417

4) Peplow M (2016) Synthetic biology’s first malaria drug meets market resistance. Commercial use of genetically engineered yeast to make medicine has modest impact. Nature 530 (7591) https://www.nature.com/news/synthetic-biology-s-first-malaria-drug-meets-market-resistance-1.19426

5) Lu Y (2017) Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and Systems Biotechnology 2(1):23-27. doi: 10.1016/j.synbio.2017.02.003

6) Kuo J i sur. (2017) Synthetic genome recoding: new genetic codes for new features. Curr Genet.  (u tisku) doi: 10.1007/s00294-017-0754-z.

7) Callaway E (2016) Minimal’ cell raises stakes in race to harness synthetic life. Nature 531(7596):557558 doi:10.1038/531557a

8) Kratki video o tome što je to sintetička biologija  https://youtu.be/rD5uNAMbDaQ