Evolucija pojma gen. Pitanje koje je proglašeno filozofskim i nebitnim postalo je bitno.

Pojam gen u znanost je uveo danski botaničar Johannsen 1909. Od tada je značio mnogo toga, od apstraktne ideje nasljednog materijala do konkretnog segmenta u molekuli DNA. Danas je jasno kako ne postoji pravocrtni put od gena prema fenotipu koji vidimo kao vanjsku manifestaciju njegovog djelovanja

• Naslovna fotografija: COVID-2019 se itekako uspješno razmnožava i prenosi kroz populaciju, a nije DNA virus

• dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković. Čačev je također članica Savjeta Ideje.hr

„To nam je u genima“, ili „sve je to zapisano u našoj DNA“, samo su neke od fraza toliko udomaćenih da se njima,  uz onu famoznu „lopta je okrugla“ i par sličnih, koriste već i sportski komentatori. Nije to loše, to je znak da su gen i DNA postali opća mjesta koja se onda i koriste u najbanalnijim prilikama. No, iako se čini da su se ti pojmovi toliko rasprostranili u našoj kolektivnoj svijesti, možda će vas iznenaditi kako ni danas ne postoji jasna i jednoznačna definicija – što  je zapravo gen?

Pitanje je a zašto bismo se uopće zamarali definicijom?  Prema nobelovcu T.H. Morganu to je bilo nebitno filozofsko pitanje kojim se genetičari u svakodnevnom radu i ne trebaju baviti. Profesor Morgan Nobelovu je nagradu dobio za istraživanja kojima je pokazao kako su geni smješteni na kromosomima koji se nalaze  u jezgrama stanica. Također je pokazao kako su geni i svojstva koja određuju u međuodnosu, koji je određen njihovim položajem na kromosomu.  Tridesetih godina prošlog stoljeća, kada je prof. Morgan to izjavio, genetičari su uistinu više trebali statistiku na razini populacije nego što su se bavili istraživanima na molekularnoj razini.

Zašto bismo se zamarali definicijom gena? T. H: Morgan

No, vrijeme je pokazalo kako je bio u krivu. Danas kada imamo dostupne ogromne količine sekvenciranih genoma različitih organizama, definicija toga što je gen postaje bitna kako bismo ih mogli analizirati. Kako će računalo prepoznati neki slijed nukleotida u molekuli DNA kao gen? Moramo mu zadati neku definiciju prema kojoj će analizirati te podatke. Ovisno o tome kako definiramo gen, iz gomile podataka koje danas imamo, možemo ekstrahirati različite informacije.

Prvotna molekularna definicija gena koja je vrijedila dobrih pedesetak godina jest  da se radi o slijedu nukleotida u molekuli DNA koji kodira neki polipeptid. Na razini sekvence DNA gen ima točno definirani početak i kraj – započinje start kodonom (slijedom nukleotida ATG) a završava STOP kodonima (TAG, TAA, TGA) (slika 1). To je definicija kako da računalo u nekom slijedu nukleotida u genomu nekog organizma prepozna gen. Definicija vrijedi i danas, no njome je moguće izdvojiti kao gen svega 2% sekvence DNA u genomu čovjeka, budući da ostatak sekvence ne kodira za proteine. Radi se o velikom dijelu genoma kojeg čini, kako se nekada smatralo, tzv. junk DNA i čija je uloga do relativno nedavno bila nepoznata. Kako je profesor Gerald Fink s MIT-a rekao u jednom svom predavanju, mogli bismo je nazvati „dark mater“ ali to su nam ime već pokupili fizičari.

Slika 1. Primjer građe jednostavnog gena. Preuzeto s https://www.slideshare.net/SarbeshDDangol/introductory-terminologies-and-basic-concepts-in-analysis-of-genes-and-genomes-58963197

Danas se zna da dio ovih sekvenici iako ne kodira proteine, ipak kodira neke regulatorne, transportne i druge vrste funkcionalnih nukleinskih kiselina. Uz tRNA i rRNA koje poznajemo već dugi niz godina, ostatak čine različite vrste molekula RNA koje su otkrivene relativno nedavno i funkcija im još ni približno nije razjašnjena. Zasad se čini kako je njihova primarna uloga u regulaciji ekspresije gena. One čine puno veći udio koda u našem genomu nego geni koji kodiraju za proteine, tako da će u narednim desetljećima razumijevanje genske regulacije putem ovih molekula zasigurno biti u fokusu mnogih istraživanja.

Pojam gen u znanost je ušao s danskim botaničarem Johannsenom koji ga je prvi upotrijebio 1909.g. Od tada do danas podrazumijevao je mnogo toga, od apstraktne ideje nasljednog materijala do konkretnog materijalnog segmenta u molekuli DNA. U ovom smo stoljeću proširili prošlostoljetnu definiciju „gen je slijed nukleotida u DNA koji kodira za mRNA koja kodira polipeptid“ u „gen je slijed nukleotida u DNA koji kodira za RNA s nekom funkcijom.“ Ovako proširena definicija pokriva postojanje i RNA-only gena kao i non-protein coding RNAs poput mikroRNA, lncRNA itd (slika 2).

Slika 2. Različiti tipovi molekula RNA. Preuzeto s https://slideplayer.com/slide/7959310/

Evolucija pojma mogla bi se usporediti s procesom izoštravanja slike na mikroskopu, najprije nam je mutnjikava, ali kako vrtimo vijak za izoštravanje u pravom smjeru tako postaje jasnija. Ili nam se možda tako samo čini?

• Klasična i moderna faza

Kada razmišljamo o evoluciji pojma gen, možemo ta promišljanja ugrubo podijeliti na dvije faze, tzv. klasičnu i modernu. Dok je prva trajala gotovo cijelo prošlo stoljeće i činilo se kako su stvari konačno postale jasne, u modernoj eri koja je započela sedamdestih godina prošlog stoljeća i doživjela uzlet masovnim sekvenciranjem genoma različitih organizama, odjednom se sve zakompliciralo. Kako je i spomenuti nobelovac Morgan smatrao, pojam gen je do sredine prošlog stoljeća predstavljao imaginarni koncept, „jedinicu nasljeđivanja“  i u istraživanjima toga vremena nije bilo presudno znati koja je njegova materijalna/molekularna podloga. No, kako se sve više spoznavala materijalna osnova nasljeđivanja, od same molekule DNA do toga kako se ona zapravo nalazi u tvorbama koje nazivamo kromosomi, polako su se imaginarni koncept nasljedne jedinice i toga što ona u materijalnom smislu predstavlja počeli približavati.

Za ovu je priliku bitno spomenuti kako se iz današnje perspektive možda čini čudnim, no do otkrića molekule DNA kao nasljedne tvari bilo je dosta prijepora što zapravo nasljedna tvar jest, odnosno postojale su ideje da bi proteini mogli biti nasljedna tvar. Razlog  je bio što su kromosomi građeni i od DNA i od proteina. Kako je molekula DNA nasljedna tvar pokazao je u elegantnom eksperimentu transformacije bakterija putem bakteriofaga prof. Avery (1944.g) a dodatno su potvrdili i Hershey i Chase (1952.g.) u pokusu kojim su dokazali kako je baš DNA ta tvar koja izaziva transformaciju bakterija.¹

Kada se taj dio enigme razriješio, trebalo je staviti u suodnos pojam gena na razini klasične genetike s onime što dobivamo na temelju istraživanja u molekularnoj biologiji. Pojednostavljeno, imaginarni koncept gena kao nasljedne jedinice konačno se fizički smjestio na kromosom odnosno na molekulu DNA. Ove spoznaje su danas abeceda molekularne genetike, no u doba kada su dokazane bile su revolucionarne i nagrađene s nekoliko Nobelovih nagrada.

Ono što danas nazivamo genom, Mendel je nazvao staničnim elementima i bilo je jasno da pod time podrazumijeva nasljedne elemente koji određuju neko svojstvo organizma i imaju materijalnu formu, o kojoj nije znao ništa

No, krenimo od početka, a početak je u znanosti o nasljeđivanju Gregor Mendel kojim započinje svaki udžbenik iz genetike. O njegovom liku i djelu dalo bi se napisati zaseban tekst, no za ovu priliku spomenut ću njegove eksperimente križanja graška pomoću kojih je prvi puta smisleno osviješten koncept nasljedog elementa koji određuje neko svojstvo organizma. U samostanskom vrtu Mendel je križao različite sorte graška, one s različitom bojom cvijeta, oblikom zrna, visinom stabljike itd. Budući da je bio i vrstan matematičar, ispravno je zaključio kako u ovakvim eksperimentima treba imati priličan broj jedinki u pokusu ne bi li se dobio statistički relevantan rezultat. U tom smislu grašak je bio zahvalna biljka jer raste i daje plod relativno brzo te ne zauzima puno mjesta. Mendel naravno 1866.g, kada je objavio svoja zapažanja, nije ni približno imao spoznaja o tome što čini materijalnu osnovu nasljedne tvari ali je opisao zakonitosti kako se određena svojstva nasljeđuju u populaciji i uobličio ih u ono što danas poznajemo pod Mendelovim zakonima nasljeđivanja.²

Pri tome treba dodati da je imao iznimnu sreću u odabiru modelnog organizma i svojstava koja su bila jednostavna i kodirana samo jednim genom koji se ponašao prema modelu dominantno/recesivno. Danas znamo da je takvih monogenskih svojstava koja se tako jasno prezentiraju u fenotipu relativno malo, tako da je odlučio križati i promatrati neki drugi organizam možda bismo još pričekali neko vrijeme s osnovnim zakonima genetike. Ono što danas nazivamo genom, on je nazvao staničnim elementima i bilo je jasno da pod tim pojmom podrazumijeva nasljedne elemente koji određuju neko svojstvo organizma i imaju materijalnu formu o kojoj nije znao ništa, no kao što smo i rekli za ova populacijska opažanja u genetici to i nije bilo presudno.

Početkom Dvadesetog stoljeća postalo je jasno da imaginarni koncept gena ima jasnu materijalnu lokaciju unutar kromosoma i tada su, kako je prije spomenuto, udareni temelji klasičnog poimanja gena. Zatim je otkriveno da je DNA nasljedna tvar, te je otkriven proces genske rekombinacije, odnosno unakrsnog razmještanja gena unutar para kromosoma porijeklom od majke i oca.  Time je objašnjena mogućnost stvaranja novih kombinacija gena  u spolnim stanicama organizma, što je od presudne važnosti za evoluciju. Za citološko objašnjenje ovog genetičkog fenomena je prije spomenuti prof. Morgan i dobio Nobelovu nagradu. Tako je do tridesetih godina 20. stoljeća dotad imaginarni koncept gena poprimio neka specifična i konkretna svojstva; da se radi o nedjeljivoj jedinici nasljeđivanja koja se nalazi na točno određenom mjestu na kromosomu, nasljeđuje se, podložna je genskoj rekombinaciji i mutacijama te ima određenu funkciju. Time je zapravo poimanje gena došlo do svojeg maksimuma razumijevanja na tadašnjim razinama znanja o molekularnoj osnovi nasljedne tvari.

• Neoklasična faza

No, od sredine prošlog stoljeća otkriće da je molekula DNA materijalna osnova nasljeđivanja dovelo je do nove tzv. neoklasične faze poimanja gena. Dvostruki heliks odnosno dvolančana struktura molekule DNA opisana je sredinom 50-tih godina u jednom od najpoznatijih znanstvenih radova prošlog stoljeća, nobelovaca prof. Watsona i Cricka, koji su zapravo lukavo spojili sve dosad poznato o ovoj molekuli te rad Rosalind Franklin, koja nije za to primila adekvatno priznanje te nije podijelila s njima ovu nagradu. ^3,4

Geni su u tom periodu nedvosmisleno smješteni na kromosome, na točno određene lokuse, imaju definiranu dužinu, a u kemijskom smislu radi se o dijelovima molekule DNA. Time je uspostavljena tzv. centralna dogma molekularne biologije DNA-mRNA-protein. Taj neoklasični koncept gena, koji zapravo ni danas nije pogrešan održao se do šezdesetih godina prošlog stoljeća. Ta definicija određuje gen kao dio kromosoma, odnosno točno određeni slijed nukleotida u molekuli DNA koji kodira polipeptidni lanac.

No, otkrića različitih tipova molekula RNA koje ne završavaju translacijom u protein pokazale su kako ova „dogma“ ima sve više iznimki. Stoga je jasno da je termin „dogma“ od prvoga dana bio zapravo nesretno/nespretno odabran, jer dogma i znanost ne idu zajedno što su i kasnija otkrića samo potvrdila.

Ne radi se o tome da je ovaj smjer prijenosa nasljedne informacije neispravan, on i danas vrijedi, no nasljedna informacija se prenosi i u molekulama RNA kao što to pokazuje primjer RNA virusa u koje spada i COVID-2019 koji se itekako uspješno razmnožava i prenosi kroz populaciju a nije DNA virus. Pokazalo se i kako neki gen također može izazvati produkciju više različitih mRNA kroz proces njihovog alternativnog izrezivanja. Također, unutar gena mogu postojati i alternativna početna mjesta prepisivanja tako da jedan gen onda može dati više različitih transkripata, ovisno s kojeg mjesta u genu krene proces njihovog prepisivanja.

Nekoliko je ključnih spoznaja dovelo do toga da napukne i neoklasični koncept poimanja gena, odnosno da se shvati kako tu definiciju treba proširiti kako bi obuhavatila sve očitije iznimke od univezalnih pravila.⁵ Naime, u eukariotskim organizmima teško je, ako je uopće i moguće, naći apsolutnu granicu transkripcije. Stoga je teško i uspostaviti jednostavna opća pravila koja bi stavila u međuodnos primarne transkripte gena s konačnim produktima tih transkripata. Prevedeno na jednostavniji jezik, genom je pun preklapanja i nizova nukleotida koji jedni preko drugih kodiraju za različite transkripte, ovisno o tome s koje startne pozicije ih počnemo iščitavati, odnosno u kojem smjeru. Druga bitna spoznaja bila je kako pojedini kodirajući dijelovi nekog gena (eksoni) mogu biti sastavni dio više od jednog transkirpta. Zatim, ako promatramo gene u organelima eukariotskih mikroorganizama možemo naći puno primjera „kriptiranih“ gena odnosno gena čiji su dijelovi razbacani po odvojenim segmentima u genomu.

U posljednih nekoliko dekada otvorilo se čitavno novo područje epigenetike kojim se pokazalo kako postranskripcijske i posttranlacijske modifikacije genskih produkata mogu bitno izmijeniti količinu i funkciju konačnog genskog produkta u stanici.

I konačno spoznaja da postoje geni koji kodiraju samo za različite oblike molekula RNA koje se ne prevode u protein pokazala je da je neoklasična definicija gena bez sumnje zastarijela i da ju je potrebno redefinirati za 21. stoljeće. Bilo je ideja kako bi se neoklasičnoj definiciji jedinice koja kodira polipeptid pridodala i njena regulatorna priroda te bi se gen definirao kao nasljedna jedinica koja kodira za prostorno i vremenski reguliranu ekspresiju tog polipeptida, ali ovom definicijom opet nisu pokriveni tzv. RNA-only geni, odnosno oni čiji krajnji produkt nije protein.

Iako puno znamo o molekularnoj osnovi nasljeđivanja, definiranje pojma gen nam i dalje predstavlja problem. Prema nekima, treba se ostaviti želje za jednoznačnim definiranjem  i prihvatiti kako se radi o pojmu koji ima, uz općenito, i nekoliko drugih funkcionalnih značenja. Prema drugima pojam gen bismo trebali prestati koristiti

Dakle nakon jednog stoljeća, iako puno više znamo o molekularnoj osnovi nasljeđivanja, definiranje pojma gen nam i dalje predstavlja problem. Prema nekima, treba se ostaviti te želje za jednoznačnim definiranjem ovog pojma i prihvatiti kako se radi o pojmu koji ima, uz općenito, i nekoliko drugih funkcionalnih značenja. Prema drugim (radikalnim) mišljenjima, ako nismo u stanju definirati taj pojam onda bismo ga trebali prestati koristiti. Prema nekom srednjem načinu promišljanja, u nekim područjima poput populacijske genetike, uzgojnom križanju biljaka i životinja, primjenjenoj genetici i sl.  definicija gena kakva jest savršeno odgovara i primjenjiva je. No, kad pređemo s razine populacije na razinu jedinke ili na pojedinu stanicu i područje molekularne i razvojne genetike ova definicija više nije dovoljna.

Možda je trenutno najrevolucionarniji pomak u redefiniciji ovog pojma da ga prestanemo gledati kao neovisnu jedinicu nasljeđivanja i počnemo ga (barem za potrebe molekularne genetike)  promatrati u kontekstu regulatornih mreža u kojima sudjeluje. Ovu autonomiju gena kao jedinice nasljeđivanja možda je široj populaciji najviše približio Dawkins u knjizi Sebični gen. Ideja naravno, kako je vidljivo iz ovog teksta, nije njegova ni originalna, nego ju je samo pretvorio u mainstream. Odnosno, prebacio ju je iz akademskih rasprava na stranice dnevnih novina.

Richard Dawkins prebacio je ideju o genu kao autonomnoj jedinici nasljeđivanja iz akademskih rasprava na stranice dnevnih novina.

No, vratimo se konceptu gena kao funkcionalne jedinice unutar genetičkih mreža. Prema ovom poimanju gena, on više nije neovisna jedinica već egzistira u interakciji s drugim genima u toj mreži (slika 3). Ovaj se model na temelju svega što znamo o kompleksnim regulatornim signalnim putevima u stanici čini puno prihvatljivijim. Danas je jasno kako ne postoji pravocrtni put od gena prema nekom proteinskom produktu u stanici odnosno fenotipu koji vidimo kao vanjsku manifestaciju njegovog djelovanja. Koncept genskih regulatornih mreža bolje opisuje kompleksnost i indirektnost puta koji informacija mora proći od gena prema konačnom funkcionalnom proteinskom produktu. Zatim, svojstva koja su određena samo jednim genom su zapravo rijetkost u genomu. Većina fenotipa koji vidimo kao vanjsku manifestaciju djelovanja gena predstavljaju zapravo kompleksna svojstva koja su rezultat koordiniranog djelovanja od nekoliko, do nekoliko stotina ili čak tisuća gena. Ovo je dijelom i razlog zašto je danas i dalje teško primjerice identificirati nasljednu osnovu kompleksnih bolesti poput srčanih, parkinsonove bolesti, autizma i slično. Radi se o tome da je u etiopatologiju ovih bolesti uz okoliš koji igra bitnu ulogu, zasigurno uključeno i poremećeno djelovanje većeg broja gena koji svaki pojedinačno minimalno doprinosi konačnom fenotipu.

Slika 3. Primjer genske regulatorne mreže u embrionalnom razvoju jedne životinje. Preuzeto iz Levin M, Davidson EH. (2005) Gene regulatory networks for development. PNAS 102(14):4936-4942.

Geni za čije djelovanje postoji jasna i vidljiva veza između njihove mutacije i promjene u fenotipu obično se nalaze negdje na rubovima ovih genskih regulatornih mreža, odnosno na kraju lanca koji daje neki fenotipski output. Od njih ka fenotipu postoji relativno linearni put uzroka (mutacije) i posljedice u fenotipu. No ni ovi geni nisu neovisni, oni dolaze na kraju krakova ovih regulatornih mreža i određeni su djelovanjem svih gena koji su u toj regulatornoj kaskadi djelovali prije njih.

I za kraj ću prenijeti jedan od prijedloga Dr. Portina koji se u nekoliko navrata pokušao pozabaviti redefiniranjem pojma gen te je napisao nekoliko preglednih radova na ovu temu. U njegovom najnovijem radu predložio je zajedno s Dr. Wilkinsom pomalo nezgrapnu (kako i sam priznaje) definiciju gena:

„Gen je slijed nukleotida u molekuli DNA (čiji dijelovi ne moraju nužno biti u fizičkom kontinuitetu) koji određuje jednu ili više molekula RNA/proteina a koje djeluju u kontekstu genskih regulatornih mreža i imaju često indirektne učinke te samo iznimo kada se nalaze na rubnim djelovima ovih mreža mogu imati direktne fenotipske učinke.“ ⁵

Primjeri regulatornih mreža nisu ekskluziva bioloških sustava, one su zapravo svakodnevnica u nizu drugih sustava koje je osmislio čovjek. Stoga je vjerojatno da će i u definiranju pojma gen pomoći iskustva iz drugih područja koja se bave ovakvim tipom regulacije mreža.

Literatura:

1) https://en.wikipedia.org/wiki/Hershey%E2%80%93Chase_experiment

2) https://www.khanacademy.org/science/high-school-biology/hs-classical-genetics/hs-introduction-to-heredity/a/the-law-of-segregation

3) https://en.wikipedia.org/wiki/Rosalind_Franklin

4) http://dosequis.colorado.edu/Courses/MethodsLogic/papers/WatsonCrick1953.pdf

5) Portin P, Wilkins T. (2017) The Evolving Definition of the Term “Gene”. Genetics, 205, 1353–1364