Kako je otkriveno da su Neandertalci posjedovali neke od intelektualnih sposobnosti koje se pripisuju Homo sapiensu

Dovoljno je primjerice 1-2 g mljevene kosti dinosaurusa da bi se provela ova analiza, piše Tamara Čačev. Naravno, paleproteomika se može korisiti i za analizu fosila koji nisu toliko stari. Metoda je iskorištena i za analizu kalcificiranih zubnih plakova dobivenih s tisuću godina starih lubanja čovjeka. Rekonstruiranjem oralnog mikrobioma kao i proteina povezanih s imunosnim odgovorom dobio se uvid u evolucijsku prošlost nekih bolesti čovjeka

• dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković. Čačev je također članica Savjeta Ideje.hr

Što ostaje iza živih bića na Zemlji? U konačnici, atomi od kojih smo sazdani, a nešto malo prije konačnog raspada i biomolekule poput DNA  i proteina kao dokaz da su nekad bile dio nekog živog organizma. Sigurno ste već imali prilike pročitati vijesti o tome kako je sekvencirana DNA izolirana iz fosila dinosaura ili kosti nekog od čovjekovih evolucijskih predaka. Metodologija dobivanja kvalitetne DNA i njeno sekvenciranje iz fosilnih ostataka napredovali su velikim koracima u zadnjim desetljećima. Nova otkrića fosilnih ostataka biljaka, životinja i čovjeka s područja Kine, koja je osnažila ova istraživanja te se otvorila i udružila snage sa znanstvenicima na Zapadu, učinila su da paleologija ponovno postaje vrlo dinamično područje u kojem se gotovo na dnevnoj bazi pojavljuju nove informacije kojima se slaže a ponekad i preslaguje evolucijsko stablo života na Zemlji.

No, uzorkovanje DNA iz tako starih ostataka ima svoje limite te do danas najstariji analizirani fosilni DNA uzorak ekstrahiran iz permafrosta star oko 800 tisuća godina, dok je vremenski period koji prethodi ovom limitu zapravo još uvijek prilično nejasan ako se razmatraju biološki dokazi temeljeni na analizi DNA jer je uspješnost i broj studija koje se smatraju nedvojbenim zapravo relativno mali.

Paralelno s analizama DNA, razmatrala se i mogućnost analiziranja proteinske komponente živih organizama jer je već 50-tih godina prošlog stoljeća bilo poznato kako proteini mogu ostati puno duže sačuvani u odnosu na DNA. Zašto je tome tako? Naprosto proteina u građi nekog organizma ima puno više nego DNA, zamislite recimo nekog dinosaura i količinu proteina koju je potencijalno ostavio za sobom. Drugi je razlog da su proteini kao biomolekule rezistentniji na degradaciju. No, nedostajale su adekvatne metode njihove analize u fosilnim uzorcima, te je do danas većina molekularnih analiza fosilnih ostataka bila temeljena na sekveniciranju molekule DNA. Ipak i ovo se područje zadnjih godina intenzivno razvija te se može reći kao je popunjavanje „vremenske rupe“ u biološkim uzorcima starijim od 800 tisuća godina započelo budući da je sve više studija koje se temelje upravo na analizi proteina dobivenih iz fosilnih uzoraka koji su stari i do nekoliko milijuna godina. Tako je u prošlomjesečnom broju znanstvenog časopisa Nature¹ objavljen pregled otkrića evolucije hominina koja su rezultat napretka u ovoj grani istraživanja koja se danas naziva paleoproteomika.

Uzorci koji se koriste u ovim studijama mogu biti recentno prikupljeni kao što je to slučaj sa novootkrivenim fosilnim nalazištima, no mogu se iskoristiti i velike i dobro dokumentirane fosilne zbirke koje postoje u muzejima širom svijeta. Stoga su vodeće muzejske institucije koje imaju dobro razvijene znanstvene jedinice fokusirane na analizu paleontoloških ostataka također bitan zamašnjak ovih istraživanja. No, kod korištenja muzejskih preparata, od kojih su neki skupljeni i pred stotinjak i više godina, postoji opasnost kontaminacije uzorka proteinima stranog porijekla koja bi mogla nastati tijekom godina manipulacije ovim uzorcima. Naime, u vrijeme njihovog prikupljanja nije postojao standardiziran način kako ispravno to napraviti a da bude primjereno daljnim molekularnim analizama što je samorazumljivo budući da molekularne bioznanosti gotovo da nisu ni postojale u to vrijeme. Također, prema nekim spoznajama, biomolekule u kosturima koji su izvađeni s mjesta nalazišta počinju degradirati izvan svojeg dotadašnjeg ravnotežnog stanja, te je stoga korištenje svježe sakupljenih uzoraka svakako bolja opcija, ukoliko naravno takvih uzoraka još ima na nekom nalazištu.

Divovski dabar u usporedbi s osobom visokom 1,8 metara

No, da je to ipak moguće, pokazuje primjerice analiza proteoma uzorka dobivenog iz prve poznate lubanje Castoroides ohioensis, velikog pleistocenskog dabra koji je mogao  narasti i do 2 metra i težiti stotinjak kilograma, a nastanjivao je područje Sjeverne Amerike. Ovaj uzorak je pohranjen u depou New York State Museuma a prikupljen je 1845. godine, dakle radi se o uzorku prikupljenom prije više od 170 godina. U analizi uzorka primijenjene su specifične metode ekstrakcije proteina te je zatim dobivena proteinska smjesa analizirana masenom spektrometrijom. Jednostavno rečeno ova metoda se temelji na analizi fragmenata proteina na temelju njihove mase i naboja iz čega je moguće rekonstruirati sekvencu (slijed aminokiselina) nekog proteina. Ovom analizom su po prvi puta detektirani peptidi kolagena tipa I te hemoglobina beta te je temeljem ove analize C. Ohioensis filogenetski svrstan u red Rodentia.²

Kolagen tipa  I je dobar primjer proteina za analizu budući da je značajno prisutan u tijelu životinja i čovjeka i to u strukturama kao što su kosti i zubi koje ostaju najdulje očuvane, pa je samim time i taj protein u relativno očuvanom stanju. Iz tog razloga je metodologija koja se temelji upravo na analizi kolagena postala jedna od najzastupljenijih te se tipiziranje fragmenata kolagena i njihova analiza MS kao metoda danas naziva i „zooarcheology by mass spectrometry (ZooMS)“ te se sve više koristi u identifikaciji vrste kojima je neki fosilni ostatak pripadao. Prikaz metodologija koje su danas u primjeni u ovom području dan je na slici 1.

Slika 1. Različiti pristupi korištenja masene spektrometrije u paleoproteomici. (Preuzeto iz preglednog članka u kojem su detaljnije opisane metode koje se koriste u paleoproteomici: Cleland TP, Schroeter ER. A Comparison of Common Mass Spectrometry Approaches for Paleoproteomics. J Proteome Res. 2018 Mar 2;17(3):936-945.)

Prednost paleoproteomike je da zahtijeva relativno malo uzorka ukoliko je on dobro očuvan. Dovoljno je primjerice 1-2 g mljevene kosti dinosaurusa da bi se provela ova analiza. Radi se dakle o relativno malom uzorku u odnosu na veličinu kostura dinosaura, i to ovu metodu čini zapravo minimalno invazivnom, što je uvijek prednost, budući da kustosi zbirki nisu presretni kada im se uzorak „uništava“. Tako je u studiji iz 2017. godine analizirano svega 0.2 g uzorka dinosaura Brachylophosaurus canadensis za kojeg se smatralo da je star približno 80 milijuna godina, te je on zahvaljujući proteomskim analizama smješten na filogenetsko stablo između krokodila i nojeva.³ Značaj ove studije također leži i u tome što se smatralo kako molekularne tehnike neće biti moguće koristiti u paleontološkim analizama dinosaura. No uzimanjem uzorka proteina koji su duže očuvani u odnosu na DNA, ova studija je pokazala kako je moguće napraviti reproducibilnu analizu i ovakvog uzorka. Prema autorima, u ovoj studiji je po prvi put postignuta je pouzdanost i reproducibilnost ove metodologije, što je bila glavna zamjerka ranijim studijama ovakvog tipa. I u ovoj analizi korištene su posebne metode izolacije proteina kako bi se dobio što kvalitetniji uzorak, te je zatim primjenena masena spektrometrija udružena s bioinformatičkim analizama i otkriveno je osam peptidnih sevenci kolagena tipa 1 kojima je ovaj dinosaur smješten detaljnije na filogenetsko stablo. Od izuzetne važnosti bilo je potvrditi i da se radi o endogenom porijeklu tih peptida čime se dokazalo kako je moguće da oni opstanu u uzorcima starim i nekoliko desetaka milijuna godina.

No nisu svi znanstvenici u ovom području tako entuzijastični u prihvaćanju ovih analiza. Naime, kako se radi o visokosofisticiranim metodama i rijetkim uzorcima, te činjenici da se ovakvim istraživanjima bavi tek nekolicina istraživačkih grupa u svijetu (vodeća je grupa s Instituta Max Planck za evolucijsku antropologiju iz Leipziga), neki smatraju kako treba biti kritičan prema ovim studijama budući da se pokazalo kako su neka od ranijih istraživanja već bila dovedena pod upitnik zbog problema u samoj metodologiji analize. Kako se radi o novom području, svaka od ovih grupa razvila je svoje protokole po kojima provodi analize te ne postoji konsenzus koji bi od tih pristupa bio najispravniji. Kako to biva u znanosti, svaka od grupa ističe neke svoje specifične prednosti u metodologiji te istovremeno nalazi zamjerke drugim studijama. A neke od najčešćih zamjerki vezane su uz kvalitetu uzorka, odnosno njegovu kontaminaciju potencijalnim inhibitorima analize kao i proteinima koji nisu endogeni već su u uzorak dospjeli tijekom manipulacije. Kako je jedan od najčešće analiziranih proteina u ovim studijama prije spomenuti kolagen, problem može biti kontaminacija fosilnog uzorka nekim životninjskim ili humanim izvorom kolagena na samom mjestu iskopa ili kasnije prilikom njegove obrade. Kako je ovaj protein prilično esencijalan i stoga evolucijski očuvan u smislu sekvence već od najranijih životinja pa sve do modernih ljudi, ukoliko dođe do kontaminacije teško je razlučiti da li je analiziran stvarni fosilni proteom ili možda neki kolagen kojem je uzorak bio naknadno izložen.

Ipak, ove prepreke neće zaustaviti razvoj paleoproteomike jer osim prije spomenute duže očuvanosti proteina u odnosu na DNA, postoji i nekoliko drugih prednosti proteomskih analiza fosilnih uzoraka koje proizlaze iz svojstava samih proteina. Kako je molekula DNA zapravo uputa u kojoj je detaljni zapis sinteze svih proteina u nekom ogranizmu, jasno je da se iz sekvence aminokiselina u proteinu mogu dobiti slične informacije kao i sekvenciranjem DNA, te je stoga sekvenciranje proteina također korisno u filogenetskim analizama. To znači kako se ponekad istovremenom analizom i DNA i proteina mogu usporediti dobiveni filogenetski smještaji pojedinih fosila što dodatno osnažuje dokaze o njihovoj poziciji na filogenetskom stablu. No, analiza proteina ima i dodatne prednosti. Proteini tijekom života nekog organizma prolaze i kroz različite postranslacijske modifikacije koje također mogu biti sačuvane u fosilnom proteomu. Na temelju analiza ovih modifikacija mogu se dobiti i dodatni podaci o fiziologiji analiziranog organizma ili životnoj fazi, a to su informacije koje se ne mogu dobiti analizom molekule DNA. Naravno, paleproteomika se može korisiti i za analizu fosila koji nisu toliko stari. U takvim je uzorcima proteinska komponenta bolje očuvana, pa je moguće uz već spomenuti kolagen tipa I analizirati i proteine ekstracelularnog matriksa ili proteine plazme.

Rekonstruiranjem oralnog mikrobioma kao i proteina povezanih s imunosnim odgovorom dobio se uvid u evolucijsku prošlost nekih bolesti čovjeka

U kontekstu prethodno spomenutih spoznaja o fiziologiji organizma, ove analize mogu biti komplementarne sekvenciranju DNA te zapravo biti puno informativnije. Što je uzorak novijeg datuma, veća je njegova očuvanost, pa je tako ova metodologija iskorištena i za analizu kalcificiranih zubnih plakova dobivenih s tisuću godina starih lubanja čovjeka. Ideja je bila preko analize proteina bakterija i virusa, ali i proteina imunosnog sustava koji su u njima deponirani dobiti sliku o ishrani i životnim uvjetima tadašnjih ljudi. Iz ovih uzoraka istraživači su dobili uvid u niz bakterija koje su povezane s različitim bolestima čovjeka, također je dokazano postojanje gena za antibiotsku rezistenciju, dakle njihova prisutnost u genetskom rezervoaru mikroorganizama iako primjena antibiotika nije postojala. Rekonstruiranjem oralnog mikrobioma kao i proteina povezanih s imunosnim odgovorom dobio se uvid u evolucijsku prošlost nekih bolesti čovjeka što je također vrlo dragocijen podatak. ⁴

Jedan od najpoznatijih primjera preokreta izazvanih  primjenom ovih analiza jest s poznatog nalazišta Grotte du Renne gdje su  pronađeni ostaci koji su se pripisivali Homo sapiensu na temelju njihove kontekstualizacije u dosadašnje poznate nalaze i artefakte nakita i oruđa prisutne na nalazištu. No, to mišljenje se nije temeljilo na direktnom radiodatiranju ugljikom ili nekoj od molekularnih metoda. Stoga  su 2016. godine ovi uzorci analizirani ZooMS metodologijom te je utvrđeno kako se radi o skupini Neanderalaca čime je po prvi put ovom metodologijom pokazano kako su i Neandertalci očito posjedovali neke od intelektualnih sposobnosti koje se pripisuju Homo sapiensu. ⁵

Još jedan od takvih preokreta dogodio se objavom rada u svibnju ove godine kada je korištenjem isključivo paleoproteomskih metoda uzorak čeljusti hominina pronađen u pećini na Tibetanskom platou, procijenjene starosti više od 160 tisuća godina, na temelju razlike u jednoj aminokiselini diskriminiran kao Denisovski čovjek. Prema današnjim spoznajama, temeljenim na analizama mitohondrijske DNA, te kako se radi o vrsti koja je otkrivena 2010. godine u špilji Denisova u Sibiru, smatra se da denisovski hominin spada u rod Homo ili je podvrsta roda Homo sapiens te da zajedno s neandertalcima i modernim ljudima dijele zajedničkog evolucijskog pretka. Otkriće denisovskih hominina u Kini je prvo takvo izvan Sibira.⁶

Nesumnjivo, paleoproteomika je tek na početku, boluje od mnogih dječjih bolesti karakterističnih za rane faze primjene neke metodologije, no njezina primjena u području arheologije i paleontologije svakako je nešto što će u budućnosti upotpuniti sliku povijesti života na Zemlji.

Literatura:

1) Warren M. Move over, DNA: ancient proteins are starting to reveal humanity’s history. Nature 2019;570:433-436

2) Cleland TP, Schroeter ER, Feranec RS, Vashishth D. Peptide sequences from the first Castoroides ohioensis skull and the utility of old museum collections for palaeoproteomics. Proc Biol Sci. 2016;283(1832).

3)Schroeter ER, DeHart CJ, Cleland TP, Zheng W, Thomas PM, Kelleher NL, Bern M, Schweitzer MH. Expansion for the Brachylophosaurus canadensis Collagen I Sequence and Additional Evidence of the Preservation of Cretaceous Protein. J Proteome Res. 2017;16(2):920-932.

4) Warinner C, Rodrigues JF, Vyas R, Trachsel C, Shved N, Grossmann J, Radini A, Hancock Y, Tito RY, Fiddyment S, Speller C, Hendy J, Charlton S, Luder HU, Salazar-García DC, Eppler E, Seiler R, Hansen LH, Castruita JA, Barkow-Oesterreicher S, Teoh KY, Kelstrup CD, Olsen JV, Nanni P, Kawai T, Willerslev E, von Mering C, Lewis CM Jr, Collins MJ, Gilbert MT, Rühli F, Cappellini E. Pathogens and host immunity in the ancient human oral cavity. Nat Genet. 2014 ;46(4):336-44.

5) Welker F, Hajdinjak M, Talamo S, Jaouen K, Dannemann M, David F, Julien M, Meyer M, Kelso J, Barnes I, Brace S, Kamminga P, Fischer R, Kessler BM, Stewart JR, Pääbo S, Collins MJ, Hublin JJ. Palaeoproteomic evidence identifies archaic hominins associated with the Châtelperronian at the Grotte du Renne. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(40):11162-11167.

6) Chen F, Welker F3, Shen CC, Bailey SE, Bergmann I, Davis S, Xia H, Wang H, Fischer R, Freidline SE, Yu TL, Skinner MM, Stelzer S, Dong G, Fu Q, Dong G, Wang J, Zhang D, Hublin JJ. A late Middle Pleistocene Denisovan mandible from the Tibetan Plateau. Nature. 2019;569(7756):409-412,