Klik-kemija. Kako su Sharpless, Meldal i Bertozzi začeli novu eru funkcionalizma

Novi pristup kemiji izrastao je kao rješenje jednog od ključnih problema u proizvodnji lijekova - kako omogućiti masovnu proizvodnju spojeva koji su prepoznati kao potencijalno korisne, aktivne farmaceutske tvari

• Naslovna ilustracija: Carolyn R. Bertozzi, Morten Meldal, K. Barry Sharpless (Niklas Elmehed / The Royal Swedish Academy of Sciences)

• Mirsada Ćehić je postdoktorand u Laboratoriju za spektrometriju masa i funkcionalnu proteomiku u sklopu Zavoda za fizičku kemiju Instituta Ruđer Bošković

• Ovaj se prikaz uglavnom temelji na Priopćenju Nobelova odbora o dodjeli nagrade za kemiju za 2022.

Ove godine Nobelova nagrada za kemiju pripala je svojevrsnom znanstvenom trinitasu kojeg čine Sharpless, Meldal i Bertozzi. U mnogim prilikama više je manje, jednostavni odgovori ponekad su i najbolja rješenja, te je upravo ovogodišnja nagrada na neki način priznala jednostavnost i elegantna  rješenja. Barry Sharpless i Morten Meldal postavili su temelje klik-kemije (engl. click chemistry) te tako započeli novu eru funkcionalizma u kemiji. Oni dijele nagradu s Carolyn Bertozzi, koja je kroz primjenu tih temelja u mapiranju stanica cijeloj ovoj priči dala još jednu dimenziju. Te tzv. bioortogonalne reakcije (engl. bioorthogonal reactions) imaju veoma široku primjenu pri čemu je možda široj populaciji najinteresantnija primjena kod ciljanih tretmana raka.

Još od samih početaka moderne kemije u 18. stoljeću mnogi su kemičari inspiraciju za svoj rad tražili u prirodi. Ljepota kemijske kompleksnosti se očituje u svim živim organizmima, od mikroorganizama, preko biljaka i životinja, do čovjeka. Znanstvenici su od samih početaka pokušavali u laboratorijima konstruirati molekule koje su prisutne i važne za život različitih organizama. Ovakav pristup je posebice važan u razvoju i istraživanju lijekova. Kroz godine istraživanja i prateći razvoj tehnologije znanstvenici su uspjeli u laboratorijskim uvjetima kreirati niz kompleksnih molekula koje imaju veoma bitne uloge, no svaki taj proces je uvijek praćen različitim izazovima. Općenito sintezu molekula u laboratorijskim uvjetima prate problemi poput velikog broja sintetskih koraka, te dobivanja niza neželjenih nusprodukata koji se uklanjaju tijekom procesa priprave ciljane molekule, što u konačnici može rezultirati veoma niskim prinosima željene molekule. Ovakvi procesi su po svojoj prirodi često dugotrajni i skupi. Upravo ovaj novi smjer u kemiji donosi nove ideale i stavlja naglasak na eleganciju i funkcionalnost u radu.

Kemija koja je ‘kliknula’ – Bertozzi je otkrila golemi potencijal alkida kao kemijske ‘ručke’ koja se može koristiti za praćenje procesa unutar stanica. Danas se srodne reakcije koriste kako bi precizno ciljale tumore. (Johan Jarnestad / The Royal Swedish Academy of Sciences)

Početci ovakvog pristupa su krenuli na prijelazu stoljeća kada je Sharpless, kojem je ovo druga Nobelova nagrada za kemiju, skovao koncept klik-kemije u kontekstu funkcionalnijeg oblika kemije, temeljenog na molekularnim građevnim blokovima koji se mogu brzo i učinkovito međusobno spajati. Ova priča dobila je dodatnu dinamiku kada su Meldal i Sharpless – neovisno jedan o drugome – otkrili ono što je postalo krunski dragulj klik-kemije: bakrom kataliziranu azid-alkin cikloadiciju. Bertozzi je razvila klik-reakcije koje se mogu koristiti unutar živih organizama. Njezine bioortogonalne reakcije – koje se odvijaju bez ometanja normalne kemije stanice – primjenjuju se globalno za mapiranje funkcioniranja stanica, te su zanimljive za daljnja istraživanja zbog svog enormnog potencijala za dijagnostiku i liječenje raka.

Sharpless je 2001. godine primio svoju prvu Nobelovu nagradu za kemiju, te je počeo promovirati novi minimalistički pristup kemiji. Naglasak je bio na promjeni pristupa koji je bio prepreka razvoju novih lijekova. Ako se potencijalna aktivna farmaceutska tvar pronađe u prirodi, laboratorijski je moguće proizvesti dostatne no male količine tvari za in vitro testiranje i klinička ispitivanja. A ako se u kasnije pojavi interes za daljnju industrijsku proizvodnju, potrebna je puno veća razina efikasnosti reakcija. Sharpless je kao primjer uzeo snažan antibiotik, meropenem. Šest godina rada na kemijskom razvoju bilo je potrebno da se pronađe način za proizvodnju molekule na industrijskoj skali.

Kada je Meldal analizirao što se dogodilo u reakcijskoj posudi, otkrio je nešto neočekivano. Pokazalo se da je alkin reagirao s neočekivanim krajem molekule acil halida

Prema Sharplessu, kod sinteze novih molekula jedan su od vodećih problema bile veze između atoma ugljika važne za kemiju života. U principu, sve biološki značajne molekule imaju okosnicu koju čine na različite načine međusobno povezani ugljikovi atomi. Evolucija je razvila metode za njihovo stvaranje, ali pokazalo se da je to izuzetno teško za kemičare. Ključni problem leži u tome što atomi ugljika koji su dio različitih molekula često teško stvaraju međusobne veze bez dodatne vanjske aktivacije koja u većini slučajeva rezultira nizom neželjenih nusprodukata i velikog gubitka materijala.

Sharpless je predložio da se u reakcijama koriste manje molekule koje imaju odgovarajuću strukturu. Te jednostavne molekule tada bi se mogle međusobno povezati koristeći mostove atoma dušika ili atoma kisika, koje je lakše kontrolirati. Ako kemičari odaberu jednostavne reakcije – gdje postoji jak intrinzični poticaj da se molekule međusobno povežu – izbjegavaju mnoge nuspojave, uz minimalan gubitak materijala.

• Beskrajna raznolikost

Sharpless je ovu robusnu metodu za izgradnju molekula nazvao klik-kemijom, rekavši da, čak i ako klik-kemija ne može dati točne kopije prirodnih molekula, bit će moguće pronaći molekule koje ispunjavaju iste funkcije. Kombiniranjem jednostavnih postojećih kemijskih građevnih blokova moguće je stvoriti gotovo beskrajnu raznolikost molekula, pa je bio uvjeren da klik-kemija može generirati lijekove koji su jednako prikladni za svoju svrhu kao oni koji se nalaze u prirodi i koji se mogu proizvoditi u industrijskim razmjerima.

Sharpless je u svojoj publikaciji iz 2001. godine naveo nekoliko kriterija koji moraju biti ispunjeni da bi se kemijska reakcija nazvala klik-reakcijom. Jedan od njih je da bi se reakcija trebala odvijati u prisutnosti kisika i u vodi, koja je jeftino i ekološki prihvatljivo otapalo. Također je naveo primjere nekoliko postojećih reakcija za koje je vjerovao da ispunjavaju nove ideale koje je postavio. Ali, nitko još nije znao za briljantnu reakciju koja je postala gotovo sinonim za klik-kemiju – bakrom katalizirana azid-alkin cikloadicija.

Azidi i alkini vrlo učinkovito reagiraju kada se dodaju ioni bakra. Ova se reakcija sada globalno koristi za povezivanje molekula na jednostavan način. (Johan Jarnestad / The Royal Swedish Academy of Sciences)

Velik dio odlučujućeg znanstvenog napretka događa se kada ga istraživači najmanje očekuju. To je bio slučaj s Meldalom. Početkom ovog stoljeća razvijao je metode za pronalaženje potencijalnih farmaceutskih supstanci. Konstruirao je goleme molekularne biblioteke, koje su uključivale stotine tisuća različitih tvari, a zatim ih je sve pregledao da vidi može li neka od njih blokirati patogene procese. Dok je to radio, jednog su dana on i kolege izveli rutinsku reakciju, njihov je cilj bio reakcija alkina s acil halidom. Reakcija obično ide glatko, sve dok kemičari dodaju malo iona bakra i možda prstohvat paladija kao katalizatora. Ali kada je Meldal analizirao što se dogodilo u reakcijskoj posudi, otkrio je nešto neočekivano. Pokazalo se da je alkin reagirao s neočekivanim krajem molekule acil halida. Na suprotnom kraju bila je kemijska skupina zvana azid. Zajedno s alkinom, azid je stvorio strukturu u obliku prstena, triazol. Ova reakcija je bila nešto posebno.

Ljudi koji se razumiju u kemiju možda znaju da su triazoli korisne kemijske strukture; stabilni su i nalaze se u nekim lijekovima, bojama i poljoprivrednim kemikalijama. Budući da su triazoli poželjni kemijski građevni blokovi, istraživači su ih prethodno pokušali stvoriti od alkina i azida, ali to je rezultiralo i nizom neželjenih nusproizvoda. Meldal je shvatio da su ioni bakra kontrolirali reakciju tako da je, u načelu, nastala samo jedna tvar. Čak je i acil halid – koji se stvarno trebao vezati za alkin – ostao više-manje nedirnut u posudi. Stoga je Meldalu bilo očito da je reakcija između azida i alkina nešto izuzetno. Svoje je otkriće prvi put predstavio na simpoziju u San Diegu u lipnju 2001. godine Sljedeće godine, 2002., objavio je članak u znanstvenom časopisu, pokazujući da se reakcija može koristiti za povezivanje brojnih različitih molekula.

Bertozzi je na genijalan način modificirala poznatu, Staudingerovu reakciju, upotrijebila je za povezivanje fluorescentne molekule s azidom koji je uvela u stanične glikane, i tako omogućila mapiranje stanica

Iste godine – neovisno o Meldalu – Sharpless također je objavio rad o bakrom kataliziranoj reakciji između azida i alkina, pokazujući da reakcija funkcionira u vodi. Opisao je to kao “idealnu” klik reakciju. Sharpless je predložio da kemičari mogu koristiti reakciju za jednostavno povezivanje različitih molekula.. Gledajući unatrag, možemo vidjeti da je bio u pravu. Ako kemičari žele povezati dvije različite molekule, sada mogu relativno lako uvesti azid u jednu molekulu, a alkin u drugu, zatim ih spoje uz pomoć iona bakra. Upravo je zbog svoje jednostavnosti ova reakcija postala iznimno popularna, kako u istraživačkim laboratorijima tako i u industrijskom razvoju. Između ostalog, klik-reakcije olakšavaju proizvodnju novih materijala koji odgovaraju namjeni. Ako proizvođač plastici ili vlaknu doda azid, promjena materijala u kasnijoj fazi je jednostavna; moguće je kombinirati različite tvari koje imaju željena svojstva – npr. provode struju, hvataju sunčevu svjetlost, djeluju antibakterijski, štite od ultraljubičastog zračenja i drugo. U farmaceutskim istraživanjima, klik-kemija ima svoju primjenu u proizvodnji te optimizaciji tvari koje imaju potencijal za liječenje. Međutim, nešto što Sharpless nije predvidio je da će se koristiti i kod živih bića. Sada ćemo razotkriti drugu nit u Nobelovoj nagradi za kemiju u 2022. godini.

• Nedostižni ugljikohidrati

Ova nit počinje 1990-ih, kada su biokemija i molekularna biologija prolazile kroz eksponencijalan napredak. Koristeći nove metode u molekularnoj biologiji, istraživači diljem svijeta mapirali su gene i proteine u svojim pokušajima da razumiju kako stanice funkcioniraju. Postojao je pionirski duh i svaki dan su se stvarala nova saznanja o područjima koja su nekada bila terra incognita. Bertozzi je u to vrijeme počela mapirati glikan koji privlači imunološke stanice u limfne čvorove. Nedostatak učinkovitih alata značio je da su bile potrebne četiri godine da se shvati kako uopće glikan funkcionira. Tijekom seminara slušala je njemačkog znanstvenika koji je objašnjavao kako je uspio natjerati stanice da proizvode neprirodnu varijantu sijalične kiseline, jednog od šećera koji gradi glikane. Bertozzi se stoga počela pitati bi li mogla upotrijebiti sličnu metodu kako bi natjerala stanice da proizvode sijaličnu kiselinu s nekom vrstom kemijske ručke. Kad bi stanice mogle ugraditi modificiranu sijaličnu kiselinu u različite glikane, mogla bi upotrijebiti kemijsku ručku da ih mapira. Mogla je, na primjer, pričvrstiti fluorescentnu molekulu na dršku. Emitirano svjetlo tada bi otkrilo gdje su glikani skriveni u stanici. Bio je to početak dugog i fokusiranog rada na razvoju. Bertozzi je počela pretraživati znanstvenu literaturu za kemijske ručke i kemijsku reakciju koju bi mogla koristiti. To nije bio lak zadatak, jer je glavni preduvjet bio da drška ne smije reagirati ni s jednom drugom tvari u stanici. Morala je biti neosjetljiva na apsolutno sve osim na molekule koje je namjeravala povezati s ručkom. Ustanovila je izraz za to: reakcija između drške i fluorescentne molekule mora biti bioortogonalna, te bi mogla i učiniti da se skriveni glikani sami otkriju.

Označavanje stanica uz pomoć metaboličkog inženjeringa. N-azidoacetilmanozamin se unosi u stanice, konvertira u funkcionalizirane sijalične kiseline, te se izražavaju u glikanima na površini stanice. (The Royal Swedish Academy of Sciences)

Da skratim priču, 1997. godine Bertozzi uspjela je dokazati da njezina ideja doista funkcionira. Sljedeći proboj dogodio se 2000. godine, kada je pronašla optimalnu kemijsku ručku: azid. Modificirala je poznatu reakciju – Staudingerovu reakciju – na genijalan način, i upotrijebila je za povezivanje fluorescentne molekule s azidom koji je uvela u stanične glikane. Budući da azid ne djeluje na stanice, može se unijeti čak i u živa bića. Time je već dala važan dar biokemiji. Uz malo kemijske kreativnosti, njezina modificirana Staudingerova reakcija može se koristiti za mapiranje stanica na razne načine, ali Bertozzi i dalje nije bila zadovoljna. Shvatila je da kemijska ručka koju je koristila – azid – ima puno više za dati. Reakcija je dobro funkcionirala kada ju je testirala u stanicama. Godine 2004. objavila je reakciju klikanja bez bakra, nazvanu sojem-promovirana alkin-azid cikloadicija – i zatim pokazala da se može koristiti za praćenje glikana. Ova prekretnica također je bila početak nečeg mnogo većeg. Bertozzi je nastavila usavršavati svoju klik-reakciju, tako da radi još bolje u staničnom okruženju. Paralelno s tim, ona i mnogi drugi istraživači također su koristili te reakcije kako bi istražili kako biomolekule međusobno djeluju u stanicama i kako bi proučavali procese bolesti. Mnogi su istraživači također počeli razvijati protutijela koja se mogu kliknuti i koja ciljaju na niz tumora. Nakon što se antitijela vežu za tumor, ubrizgava se druga molekula koja klikne na antitijelo. Na primjer, to bi mogao biti radioizotop koji se može koristiti za praćenje tumora pomoću PET skenera ili koji može usmjeriti smrtonosnu dozu zračenja na stanice raka. Još ne znamo hoće li ove nove terapije djelovati – ali jedno je jasno: istraživanje je upravo dotaklo golemi potencijal klik-kemije i bioortogonalne kemije.

• Dodatna literatura

1. Sharpless, K. N., Klob, H. C. Click Chemistry: A Concept for Merging Process and Discovery Chemistry. In Book of Abstracts, 217th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., March 21-25, ORGN-105, 1999.
2. Klob, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40(11), 2004-2021.
3. Berg, R., Straub, B. F. Advancements in the Mechanistic Understanding of the Copper-Catalyzed Azidealkyne Cycloaddition. Beilstein J. Org. Chem. 2013, 9. 2715-2750.
4. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell Surface Engineering by a Modified Staudinger Reaction. Science 2000, 287 (5460), 2007–2010.
5. Prescher, J. A., Dube, D. H.,Bertozzi, C. R. Chemical Remodelling of Cell Surfaces in LivingAnimals. Nature 2004, 430 (7002), 873–877.
6. Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130 (34), 11486–11493.
7. Takayama, Y.,Kusamori, K., Nishikawa, M. Click Chemistry as a Tool for Cell Engineering and Drug Delivery. Molecules 2019, 24 (1), 172.
8. Porte, K., Riberaud, M., Châtre, R., Audisio, D., Papot, S.; Taran, F. Bioorthogonal Reactions in Animals. ChemBioChem 2020, 22 (1), 100–113.