Svante Pääbo i otkrivanje dijelova genoma zajedničkih modernom čovjeku i Neandertalcu

Pääboa se smatra utemeljiteljem nove znanstvene discipline - paleogenomike. Na temelju njegovih otkrića rekonstruirana je evolucijska crta prema kojoj su istovremeno dok je Homo sapiens migrirao iz Afrike Neandertalci živjeli u zapadnoj, a Denisovci u istočnoj Euroaziji. Homo sapiens se s njima susretao i križao. Razlike između ovih skupina zanimljive su i s aspekta identifikacije onih dijelova genoma koje su nas učinile jedinstvenima u odnosu na njih.

• dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković. Čačev je također članica Savjeta Ideje.hr

Ove je godine Nobelova nagrada za fiziologiju ili medicinu, prva kojom se otvara tjedan Nobela u listopadu, dodijeljena profesoru Svanteu Pääbu, švedskom antropologu i genetičaru za njegova otkrića na polju rekonstrukcije genoma izumrlih Hominina te evolucije čovjeka. Pääbo je rođen u Stockholmu 1955. godine, završio je medicinu te doktorirao na Sveučilištu u Uppsali. Tijekom karijere boravio je na znanstveno istraživačkim institutima u Zurichu, Londonu te na Sveučilištu Berkeley. Krajem 90-tih preuzeo je vođenje Odjela za evolucijsku genetiku pri Max Planck Institutu za evolucijsku antropologiju u Leipzigu. Ne može se reći kako je prije dobivanja Nobelove nagrade bio nepoznat i nepriznat znanstvenik što je ponekad slučaj s drugim laureatima. Njegov je doprinos uvođenju molekularno genetičkih dokaza u teoriju evolucije prepoznat na nizu institucija koje su mu dodijelile i počasne doktorate i nagrade te članstva u nacionalnim akademijama. Zanimljivo je da je i dopisni član Hrvatske akademije znanosti i umjetnosti od 2012. godine te dobitnik medalje Gorjanović-Kramberger. To ne čudi s obzirom na to da su ga istraživanja neminovno vodila u naše krajeve i nalazišta jedne od ključnih karika u evoluciji čovjeka. Značajan je i broj znanstvenika iz Hrvatske koji su sudjelovali u istraživanjima koja su bila osnova za ovogodišnju nagradu (popis na kraju teksta).

Pääbo i njegovi suradnici su prvi dali kvalitetnu sekvencu genoma Neandertalca. Usporedba lubanje suvremenog Homo sapiensa i Neandertalca. (Wikimedia Commons)

Najveći doprinos Svantea Pääboa cjelokupnom znanstvenom korpusu a posebice molekularnoj antropologiji  i njenoj grani paleogenomici je u razvoju tehnika i pristupa kojima se po prvi put uspješno odredila sekvenca molekule DNA iz arheoloških i paleontoloških ostataka. Time je napravljen ogroman iskorak u pribavljanju znanstvenih dokaza o molekularnoj evoluciji čovjeka ali i svih drugih organizama uključujući čak i patogene. Pääbo i njegovi suradnici su prvi dali kvalitetnu sekvencu genoma Neandertalca, našeg izumrlog srodnika. Također je zahvaljujući molekularnom profiliranju bioloških ostataka praljudi uspio po prvi puta na molekularnoj razini razdvojiti i dokazati postojanje specifičnog i dotad nepoznatog roda Hominina iz paleolitika, tzv. Denisovskog čovjeka. Pokazao je i kako je između Homo sapiensa i Denisovaca postojao prijenos gena i to nakon njihovog odlaska iz Afrike prije kojih sedamdesetak tisuća godina. Što je još značajnije, radi se o genima koji su bitni za našu fiziologiju primjerice genima koji danas kodiraju naš imunološki odgovor na infekcije patogenima.

• Nova znanstvena disciplina

Do paleogenomike, istraživanja evolucije čovjeka temeljila su se na analizama ostataka kostiju i njihovih morfoloških karakteristika kao i ispitivanjima oruđa kojima su se čovjekovi preci koristili te drugim arheološkim artefaktima. Prvi ostaci kostura naših predaka otkriveni su u Neandertalu u Njemačkoj 1856.g. Ubrzo su uslijedila nova nalazišta Neandertalaca na raznim lokacijama diljem Euroazije. Moderan čovjek, Homo sapiens se prema sada dostupnim podacima prvi puta pojavio prije 300 tisuća godina u Africi. Naši su najbliži srodnici Neandertalci, koji su se razvili izvan Afrike i nastanili Europu i zapadnu Aziju u razdoblju koje je započelo prije približno 400 tisuća godina i trajalo je kojih 370 tisuća godina, sve do prije 30 tisuća godina kada se smatra da su Neandertalci izumrli. Negdje prije otprilike 70 tisuća godina skupine Homo sapiensa su migrirale iz Afrike prema srednjem istoku te se proširile na ostatak svijeta . Na temelju ove kronologije jasno je kako su Homo sapiens i Neandertalac bili na istom mjestu u isto vrijeme nekoliko desetaka tisuća godina. No o njihovoj kohabitaciji se na temelju klasičnih materijalnih paleontoloških dokaza nije moglo previše zaključiti. Jesu li živjeli kao odvojene grupe bez interakcija, u sukobu ili u dobrim odnosima? Nove odgovore na to dala je upravo paleogenomika odnosno detaljna analiza njihovih genoma koja je pokazala kako su bili u prisnijim odnosima nego li se prethodno moglo pretpostavljati.

Komparativnom analizom genoma dobivenog iz kosti Neandertalca iz Njemačke te Denisovskog čovjeka iz južnog Sibira sastavljeno je filogenetsko stablo koje pokazuje evolucijske međuodnose Homo sapiensa i izumrlih Hominina te prijenos gena (gene flow) s ove dvije grupe na Homo sapiensa. (Preuzeto s nobelprize.org)

Kako su stvorene pretpostavke za takve analize? Krajem prošlog stoljeća definirana je konsenzusna sekvenca genoma čovjeka. Pothvat je trajao desetak godina, uključivao javno-privatno partnerstvo niza akademskih institucija i tvrtki koje su se bavile razvojem tehnologije za sekvenciranje. Prvi genom je zapravo bio hibridno očitanje DNA genoma desetak pojedinaca i koštao je oko 3.5 milijarde dolara. Doprinos projekta je naravno bio veliki znanstveni ali i tehnološki iskorak, toliki da danas možemo dobiti sekvencu čitavog genoma čovjeka za nekoliko dana i nekoliko stotina dolara. No ovdje se radi o svježim uzorcima koji nisu doživjeli propadanje usljed atmosferskih i drugih uvjeta tijekom godina. Već je identifikacija žrtava iz masovnih grobnica koja se radi analizom nesuporedivo manjih fragmenata molekule DNA predstavljala izazov. Zamislite kako je tek rekonstruirati cjelokupni genom bića koje je živjelo prije nekoliko desetaka i stotina tisuća godina.

S vremenom, molekula DNA se u biološkim ostacima kemijski modificira i degradira u manje fragmente. To znači da nekon nekoliko tisuća godina imamo samo tragove DNA, a i oni su nažalost često kontaminirani genomima drugih organizama kao što su bakterije, ili modernih ljudi koji su rukovali ostacima. Tijekom 1988. u svojim je istraživanjima Pääbo prvi put primijenio tehniku umnažanja uz pomoć enzima za lančanu reakciju polimeraze na prahistoriskim biološkim ostacima. Iako su i drugi laboratoriji to pokušavali, susretali su se s problemima degradacije i kontaminacije DNA (na sličan način kako se danas susreću i forenzičari). Pääbo je prvi uspostavio sustavne protokole tzv. ‘čistih soba’ kako bi se problemi proizašli iz rukovanja uzorcima nakon njihovog otkrića sveli na minimum. Tijekom desetljeća koja su uslijedila njegov je tim razvio metode za izolaciju DNA iz drevnih uzoraka, zatim metode njenog pročišćavanja te detekcije kontaminacije.

Do paleogenomike, istraživanja evolucije čovjeka temeljila su se na analizama ostataka kostiju i njihovih morfoloških karakteristika kao i ispitivanjima oruđa kojima su se čovjekovi preci koristili

Tijekom devedesetih godina zadatak današnjeg Nobelovca bio je da na Sveučilištu u Münchenu pokuša razviti analizu DNA iz substanične organele, mitohondrija koji sadrže svoju DNA. To se činilo kao dosegljiv cilj jer se radi o molekulama veličine oko 16.5 tisuća parova baza koje su prisutne u mnogo kopija dok je cijeli genom koji je dominantno smješten u jezgri stanice veličine 3 milijarde parova baza prisutan u svega dvije kopije po stanici. Nakon godina mukotrpnog rada koje su danas urodile Nobelovom nagradom, uspio je razviti sofisticirane metode kojima je sekvencirao dio mitohondrijske DNA iz kosti stare 40 tisuća godina. Radilo se u konačnici o segmentu od 61 para baza koji se međutim značajno razlikovao od dosad poznatih sekvenci. Eksperiment je ponovljen nekoliko puta i potvrđen u neovisnom laboratoriju što je također bilo uvođenje novih standarda u ova istraživanja. Usporedbom dobivene sekvence DNA s genomom suvremenog čovjeka i čimpanze po prvi je put neoborivo dokazano na molekularnoj razini da je Neandertalac genetički različit od ove dvije skupine. Kasnijim sekvenciranjem preklapajućih uzoraka došlo se do ukupne sekvence od 379 nukleotida mitohondrijske DNA.

Pääbou su naši znanstvenici ustupili male uzorke kostiju 15 Neandertalaca koji su metodom C-14 datirani na starost od 42 tisuće godina. Špilja Vindija, spomenuta u priopćenju Nobelova odbora, jedan od najboljih izvora neandertalskih ostataka, danas je zaštićena kao paleontološki spomenik prirode.  (Wikimedia Commons)

Kako se mitohondrijska DNA nasljeđuje isključivo po majci (prisjetimo se da su cjelokupni sadržaj jajne stanice i organeli porijeklom od majke), prijenos u iduću generaciju ide samo po ženskoj liniji čime dobivamo ipak ograničenu sliku povijesti genoma. Kako prati žensku liniju, mitohondrijska DNA pokazuje je li bilo miješanja ženskih jedinki između pojedinih grupa. No, ta ženska nit se može izgubiti ako neka od ženskih jedinki ima samo sinove. Budući da su se u Nobelovom odboru u obrazloženju dotakli i značaja Vindije kao bitnog nalazišta kosti Neandertalca red je da i to spomenemo. Radi se o specifičnim vapnenačkim pećinama koje imaju dobre ‘atmosferske’ uvjete za dužu očuvanost molekule DNA zbog lagano lužnatog okoliša. Tijekom Pääbovog posjeta HAZU, naši su mu znanstvenici ustupili male uzorke kostiju 15 Neandertalaca koji su metodom C-14 datirani na starost od 42 tisuće godina. Uzorci su se pokazali visokokvalitetnima i nekontaminiranima što je stvarno uspjeh s obzirom na to da u doba njihovog otkrića molekularna biologija nije postojala, a kamoli neke mjere opreza u rukovanju uzorcima radi izbjegavanja kontaminacije.

Tijekom kohabitacije na istim prostorima došlo do križanja između Homo sapiensa i Neandertalca, stoga u genomu današnjih ljudi porijeklom iz Euroazije 1-4% genoma potječe od Neandertalaca

Sljedeći izazov kojeg se Pääbo prihvatio bilo je sekvenciranje glavnine genoma koji se nalazi u jezgri stanice. Za to je također bilo potrebno razviti novu metodologiju što je 2010. nakon skoro desetljeća napornog rada niza timova na novoosnovanom ogranku instituta Max Planck u Leipzigu urodilo prvom sekvencom genoma Neandertalca. Na temelju ovih istraživanja također je dokazano kako je najbliži zajednički predak Neandertalca i Homo sapiensa živio negdje prije 800 tisuća godina. Daljnjim komparativnim analizama genoma Pääbo i njegov tim su pokazali kako je Neandertalac bliži suvremenom čovjeku porijeklom iz Europe i Azije nego modernim ljudima porijeklom iz  Afrike. Iz ovog se može zaključiti kako je tijekom kohabitacije na istim prostorima došlo do križanja između Homo sapiensa i Neandertalca. Stoga u genomu današnjih ljudi porijeklom iz Euroazije 1-4% genoma vuče porijeklo od Neandertalaca. Zatim je uslijedila analiza genoma ostataka kosti pronađenih u špilji Denizova u Sibiru kojom je pokazano kako se radi o novom filogenetskom entitetu, novom Homininu, u odnosu na Neandertalca ali i modernog čovjeka te da je među njima došlo do prijenosa gena. Taj je prijenos najprije utvrđen komparativnom analizom genoma JI Azije gdje moderni ljudi imaju i do 6% genoma porijeklom od Denisovskog čovjeka.

• Susreti s Neandertalcima i Denisovcima

Na temelju ovih otkrića rekonstruirana je evolucijska vremenska crta prema kojoj su istovremeno dok je Homo sapiens migrirao iz Afrike dvije različite populacije Hominina nastanjivale Euroaziju. Neandertalci su živjeli u zapadnoj, a Denisovci u istočnoj Euroaziji. Tijekom širenja izvan Afrike na istok Homo sapiens se susretao i križao s Neandertalcima i Denisovcima. I Neandertalci su koristili oruđe i imali relativno velik mozak, no nisu ostvarili daljnji evolucijski iskorak te su izumrli za razliku od Homo sapiensa. Stoga su razlike na razini genoma između ovih skupina zanimljive i s aspekta identifikacije onih dijelova genoma koje su nas učinile jedinstvenima u odnosu na njih.

Migracije Homo sapiensa i susreti s Neandertalcima i Denisovcima. (Preuzeto s nobelprize.org)

Nove tehnologije visokoprotočnog sekvenciranja iskorištene su i u ovim istraživanjima gdje je upravo upotrebljena prije spomenuta dobro očuvana kost iz Vindije. Na temelju nje napravljen je prvi genom Neandertalca veličine milijun parova baza koji je objavljen 2006.godine. Što se tiče sličnosti našeg genoma s genomom Neandertalaca možemo reći kako segmente koji vuku porijeklo od ove skupine nalazimo posvuda u našem genomu. Pokazano je kako je gen EPAS1 koji sudjeluje u signalnom putu za hipoksiju i omogućava nam da preživimo na visokim nadmorskim visinama porijeklom od Denisovaca. Danas ga nalazimo u genomu suvremenih Tibetanaca. Drugi primjer takve premreženosti genoma je klaster gena za tri Toll-like receptora TLR6-TLR1-TLR10 koji su bitni za prepoznavanje patogena i alergijske reakcije.

Pääbo je također i dopisni član Hrvatske akademije znanosti i umjetnosti od te dobitnik medalje Gorjanović-Kramberger. Ovo ne čudi obzirom da su ga istraživanja vodila u naše krajeve

Karijera je Pääboa odvela u komparativnu i funkcionalnu genomiku čovjeka i majmuna s naglaskom na gen FOXP2 koji se smatra zaslužnim za nastanak sposobnosti govora i jezika svojstvenih samo čovjeku. Otkrivanjem zajedničkih dijelova genoma današnjeg čovjeka i Neandertalaca s jedne je strane dokazao evolucijski kontinuitet u razvoju naše vrste, no također je iz razlika u genomima pokazao koji su to dijelovi genoma koji su jedinstveni i svojstveni samo modernom čovjeku. U tim se dijelovima možda krije tajna našeg evolucijskog uspjeha naspram naših evolucijskih rođaka a kontinuirani napredak i sve bolje metode izolacije nukleinskih kiselina iz arhivskih uzoraka kao i metode sekvenciranja genoma omogućuju neiscrpan bazen evolucijskih istraživanja za čitave generacije novih molekularnih antropologa. Već sam u prethodnim tekstovima za Ideje pisala o potencijalnom oživljavanju izumrlih vrsta poput primjerice mamuta. Nedavno je sekvencionirana DNA izolirana iz zuba mamuta starog milijun godina koji je bio dobro sačuvan zahvaljujući tome da je bio smrznut u permafrostu. Bez otkrića kojima je Pääbo pridonio nikada ne bismo imali sekvence ovih genoma, koje istina ni sada nisu potpune, no itekako bi mogle poslužiti za neki novi Jurski park o kojima znanstvenici sanjaju.

• Radovi koji čine osnovu za Nobelovu nagradu 2022:

1) Krings M, Stone A, Schmitz RW, Krainitzki H, Stoneking M, Pääbo S. Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell. 1997:90:19-30.

2) Green RE, Krause J, Briggs AW, Maricic T, Stenzel U, Kircher M, Patterson N, Li H, Zhai W, Fritz MH, Hansen NF, Durand EY, Malaspinas AS, Jensen JD, Marques- Bonet T, Alkan C, Prüfer K, Meyer M, Burbano HA, Good JM, Schultz R, Aximu-Petri A, Butthof A, Höber B, Höffner B, Siegemund M, Weihmann A, Nusbaum C, Lander ES, Russ C, Novod N, Affourtit J, Egholm M, Verna C, Rudan P, Brajkovic D, Kucan Ž, Gušic I, Doronichev VB, Golovanova LV, Lalueza-Fox C, de la Rasilla M, Fortea J, Rosas A, Schmitz RW, Johnson PLF, Eichler EE, Falush D, Birney E, Mullikin JC, Slatkin M, Nielsen R, Kelso J, Lachmann M, Reich D, Pääbo S. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 2010:328:710-722.

3) Krause J, Fu Q, Good JM, Viola B, Shunkov MV, Derevianko AP, Pääbo S. The complete mitochondrial DNA genome of an unknown hominin from southern Siberia. Nature. 2010:464:894-897.

4) Reich D, Green RE, Kircher M, Krause J, Patterson N, Durand EY, Viola B, Briggs AW, Stenzel U, Johnson PL, Maricic T, Good JM, Marques-Bonet T, Alkan C, Fu Q, Mallick S, Li H, Meyer M, Eichler EE, Stoneking M, Richards M, Talamo S, Shunkov MV, Derevianko AP, Hublin JJ, Kelso J, Slatkin M, Pääbo S. Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia. Nature. 2010:468:1053-1060.

5) Meyer M, Kircher M, Gansauge MT, Li H, Racimo F, Mallick S, Schraiber JG, Jay F, Prüfer K, de Filippo C, Sudmant PH, Alkan C, Fu Q, Do R, Rohland N, Tandon A, Siebauer M, Green RE, Bryc K, Briggs AW, Stenzel U, Dabney J, Shendure J, Kitzman J, Hammer MF, Shunkov MV, Derevianko AP, Patterson N, Andrés AM, Eichler EE, Slatkin M, Reich D, Kelso J, Pääbo S. A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual. Science. 2012:338:222-226.

6) Prüfer K, Racimo F, Patterson N, Jay F, Sankararaman S, Sawyer S, Heinze A, Renaud G, Sudmant PH, de Filippo C, Li H, Mallick S, Dannemann M, Fu Q, Kircher M, Kuhlwilm M, Lachmann M, Meyer M, Ongyerth M, Siebauer M, Theunert C, Tandon A, Moorjani P, Pickrell J, Mullikin JC, Vohr SH, Green RE, Hellmann I, Johnson PL, Blanche H, Cann H, Kitzman JO, Shendure J, Eichler EE, Lein ES, Bakken TE, Golovanova LV, Doronichev VB, Shunkov MV, Derevianko AP, Viola B, Slatkin M, Reich D, Kelso J, Pääbo S. The complete genome sequence of a Neanderthal from the Altai Mountains. Nature. 2014:505: 43-49.