Sprečavanje epidemija, zaštita okoliša. Što je eDNA i kako i amateri mogu biti korisni istraživačima?

Pretpostavlja se da između 80 posto i 90 posto vrsta na našem planetu još nije otkriveno, piše Tamara Čačev i pojašnjava novu metodu istraživanja složenih interakcija života i okoliša koja nalikuje forenzici iz kriminalističkih serija. Dok dio terenskog rada za njih mogu obaviti drugi, čak i na turističkim putovanjima, znanstvenici se u laboratorijima mogu posvetiti analizi prikupljenih podataka

• Naslovna fotografija: Daždevnjak Andrias japonicus, rođak Cryptobranchus alleganiensis daždevnjaka (Animalia / CC BY 2.0)

• Dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković. Čačev je također članica Savjeta Ideje.hr

Neki od mojih najranijih susreta s biologijom bile su dokumentarne televizijske emisije poput Opstanka. Tamo su uvijek bili prikazani neki egzotični krajevi, najčešće afričke savane, i u njima lavovi, zebre, žirafe i slonovi koje bi istraživač ili istraživačica prebrojavali, uspavljivali i obilježavali. Činio mi se to posao iz snova i već kao osnovnoškolka intenzivno sam se raspitivala kako netko postane jedan od tih ljudi u safari kompletićima i maskirnim jeepovima. Naravno, vremena se mijenjaju, danas možemo u visokoj rezoluciji u krupnom planu pratiti život nikad prije viđene najmanje mačke na svijetu, a imam osjećaj da neki lavovi već i poziraju koliko puta su snimljeni za različite dokumentarce. Klasično prebrojavanje jedinki više nije toliko zanimljivo jer su na scenu stupile nove tehnologije proizašle iz razvoja molekularne biologije a koje su posebno korisne i primjenjive za proučavanje onih dijelova živog svijeta koji nam je dosada izmicao zbog svoje skrovitosti. I toj je tajnovitosti došao kraj jer se i te samozatajne životinjice danas može otkriti forenzičkim metodama sličnim onima iz kriminalističkih serija. Jer, naravno, sve što je živjelo ili živi na Zemlji, bilo samostalno ili kao infektivni agens, za sobom ostavlja tragove DNA u okolišu, tzv. okolišnu DNA (environmental DNA, eDNA).

Definicijski gledano, eDNA predstavlja genetički materijal koji je dobiven iz okoliša (bili to zrak, tlo, voda ili led) a ne direktno od nekog organizma. Ova DNA može potjecati iz stanica kože, perja, krzna, izmeta, sline ili bilo kojeg drugog organskog traga koji organizam ostavlja za sobom. To je svojevrsni molekularni potpis njegove prisutnosti u nekom prostoru koji ostaje iako sam organizam možda nismo uopće vidjeli, bilo zbog njegovog načina života ili zbog njegove veličine, kao što je to slučaj s mikroorganizmima. Niz takvih „potpisa“ na nekom staništu u nekom trenutku u vremenu daje nam informaciju o tom ekosustavu. Ovaj je pristup također pogodan i za analizu organizama na velikim dubinama u oceanima ili u područjima vječnog leda, gdje su terenska istraživanja nemoguća ili izrazito otežana.

Dok ste prije morali skupiti jedinke i odnijeti ih u laboratorij i identificirati klasičnim taksonomskim metodama, sad su vam potrebni samo uzorci vode u kojima je njihova eDNA

Koliko terenska istraživanja mogu biti mukotrpan posao, daleko teži od glamuroznog brojanja lavova, jest primjer praćenja populacije daždevnjaka Cryptobranchus alleganiensis na sjeveroistoku SAD. Kako bi se uočila neka od ovih jedinki treba satima gledati u plićake potoka, podizati kamenje ispod kojih bi se mogli skrivati, te na taj način možda pregledati 2-3 lokaliteta u danu. Korištenje eDNA ova je istraživanja svelo na uzimanje uzoraka vode na različitim lokacijama, kojih je tako moguće obići puno više u jednom danu. Dobivanje uzoraka iz takvog okoliša bez potrebe da i sam istraživač bude u njemu prisutan duže vrijeme kako bi identificirao jedinke koje opaža od velikog je značaja za napredak istraživanja u surovijim dijelovima našeg planeta, a ovakva istraživanja su također neinvazivna i ne stresiraju jedinke. Jer, dok ste prije morali skupiti jedinke i odnijeti ih u laboratorij i identificirati klasičnim taksonomskim metodama, sad su vam potrebni samo uzorci vode u kojima je njihova eDNA, čime se i postupak analize značajno ubrzava. Također, iz istog uzorka se istovremeno može identificirati i druge prisutne organizme, a na podatke se može i naknadno vratiti u cilju dodatnih analiza. Tako danas primjerice znamo da na točno određenoj livadi u Danskoj na divlji cvijet slijeće više od 100 različitih vrsta insekata, a možete zamisliti koliko bi trajalo dok ih sve ne uočite u prirodi.

Ideja o analizi DNA koju u okolišu ostavljaju organizmi nije nova, te je i ranije (80-ih i 90-ih) bilo pokušaja korištenja ovog pristupa u ekološkim i evolucijskim istraživanjima. No, pravu revoluciju je doživjela tek razvojem novih metoda detekcije. Imati mogućnost otkrivanja prisustva organizama koje prije nismo mogli ni vidjeti niti golim okom identificirati uvelike mijenja i tradicionalni način kako se prate parametri okoliša kroz vrijeme. To je posebno bitno kod studija u kojima se prati očuvanost okoliša i bioraznolikosti (područje konzervacijske biologije) a koje su se prije tradicionalno oslanjale na praćenje svega nekoliko vrsta biljaka, ptica, sisavaca i sličnih živih bića koje je čovjeku bilo jednostavno pratiti. Korištenjem molekularne detekcije prisutnosti eDNA različitih vrsta u okolišu otvara se mogućnost praćenja njihove dinamike uvjetovane okolišnim čimbenicima u sustavu, koji je tako opisan s puno više parametara. Ovim se  metodama također mogu mapirati puno veća područja kao i vremenski periodi, te na temelju tih podataka rekonstruirati čitave životne zajednice na nekom području. To otvara mogućnosti koje su više od pukog popisivanja vrsta u nekoj zajednici budući da se na taj način mogu pratiti i njihove promjene, što je posebno bitno u naporima očuvanja ugroženih vrsta.

Kako se radi o vrlo osjetljivim metodama detekcije, od esencijalne važnosti je da se uzorak ne kontaminira s DNA koju smo mi unijeli neadekvatnim rukovanjem uzorkom. Kada uzorak dođe u analitički laboratorij, izolira se DNA te se zatim umnaža procesom lančane reakcije polimeraze te se zatim u njoj „traže“ specifične sekvence koje služe kao identifikacijski biljezi određene vrste.

U novije vrijeme moguće je  analizu eDNA napraviti čak i na licu mjesta budući da su u nazad nekoliko godina razvijeni prijenosni uređaji za sekvenciranje čitavog genoma. Ovakvo istraživanje prisutnosti genomskih DNA ali i RNA mikroorganizama (bakterija i virusa) omogućuje rano in situ otkrivanje potencijalnih izvorišta novih epidemija, poput primjerice ebole ili Zika virusa.

Rezultati dobiveni nekom od ovih analiza uspoređuju se s poznatim sekvencama genoma organizama u bazama podataka te se na taj način identificiraju organizmi koji su prisutni u nekom uzorku. Na ovaj se način zapravo dobiva prostorna i vremenska snimka nekog okoliša a ti se podaci mogu integrirati i s drugim opservacijskim studijama kako bi se dobila što je moguće sveobuhvatnija slika tog ekosistema. Ovakve prostorno/vremenske snimke korisne su za praćenje promjena u okolišu odnosno kao ekosistem na njih reagira kad su one negativne poput klimatskih promjena, ali i kada aktivno nastojimo obnoviti neka staništa.

Ovakve studije mogu promijeniti stavove lokalne zajednice o vrstama koje smatraju štetnim. Tako je već 2010. godine na temelju eDNA u izmetu šišmiša koje su lokalni uzgajivači šećerne trske u Eswatini (nekadašnji Swaziland) smatrali štetnim, pokazano kako se oni zapravo hrane štetnim insektima i tako ih zapravo drže pod kontrolom (detalji su u studiji Bohmann K i sur. PLoS One. 2011;6(6):e21441).

Osim očite koristi na teško pristupačnim područjima bez struje u siromašnim dijelovima svijeta gdje okolišna istraživanja počesto nisu na listi prioriteta financiranja, takvi se projekti pokreću i u razvijenim sredinama čime se potiče društvena angažiranost lokalne zajednice. Tako se primjerice pozivaju stanovnici da prikupljaju i šalju uzorke dobivene iz obližnjeg potoka ili parka. Ovi projekti su dio šire priče oko poticanja uključenosti građanstva u znanstvene aktivnosti čime se želi postići bolja interakcija znanosti i javnosti kroz praksu koju nazivamo „citizen science“. Tako je u projekt GenePools prošle godine uključeno 200 volontera iz Bristola, Londona i Newcastlea prilikom kojeg su prikupljeni uzorci iz 164 potoka te je pronađeno oko 2250 vrsta organizama od mikroba pa sve do bumbara, parazitskih osa i lisica ali i uzoraka domaćih životinja poput kokoši i pasa. Danas možete otići i na ekoturistički obilazak Amazone na kojem možete prikupljati uzorke eDNA za slične studije. To znači da i amateri mogu sudjelovati u istraživanjima čime je eliminirana potreba za iskusnim ekspertima na terenu kojih ionako nema u izobilju.

Mogućnost praćenja promjena molekularnih potpisa vrsta koje ostavljaju na nekom staništu bitno je za monitoring ugroženih vrsta ali i za rekonstruiranje prošlih uvjeta okoliša kroz primjenu u paleoekologiji. Praćenjem promjena u sastavu ekosustava kroz vrijeme, primjerice uzorkovanjem leda na polovima ili permafrosta dodaje se još jedan sloj dokaza o uvjetovanosti evolucijskih procesa okolišnim čimbenicima.

U poljoprivredi je eDNA korisna za ranu detekciju štetnika (insekata i korova) kao i patogena koji nisu vidljivi golim okom kako bi se u ranoj fazi spriječila epidemija te poduzele primjerene preventivne mjere. Tako se mogu pomoću eDNA detektirati ličinke insekata u vodi te se već u tom stadiju može intervenirati. Time se omogućava ciljano i učinkovitije primjenjivanje pesticida i herbicida te se otvaraju vrata manje agresivnim načinima uklanjanja štetnika budući da je problem otkriven u vrlo ranoj fazi. Može se djelovati i koordiniranim puštanjem predatora kojima su neki štetnici poput glodavaca meta. Proteklih su godina i kod nas puštane populacije sterilnih komaraca u okoliš u točno određenom trenutku koji je najpogodniji da se suzbije rast njihove populacije. Primjena analiza eDNA korisna je i u praćenju populacija ribe, unosa invazivnih vrsta u uvjetima kada klasično uzorkovanje ne daje rezultate ali i praćenja kvalitete vode. Prisutnost eDNA peludi u zraku također je korisna u detekciji potencijalnih alergena.

Zanimljivo je i kako neki organizmi mogu biti „sakupljači“ DNA drugih organizama iz okoliša, primjerice spužve koje filtriraju vodu mogu sadržavati i DNA drugih organizama koji žive u njihovom okolišu. Prema nekim podacima, identificirano je preko trideset DNA drugih organizama u nekom primjerku spužve. Na sličan način mogu se koristiti i komarci i pijavice kako bi se utvrdio „repertoar“ organizama koji su im poslužili kao izvor hrane.

No, kako se radi o osjetljivim metodama koje detektiraju eDNA koja je sada prisutna u okolišu, ali i onu koja je tamo dospjela i davno prije, to predstavlja nedostatak ove metodologije. S druge pak strane, ako su okolišni uvjeti nepovoljni (temperatura, pH, UV zračenje itd.) to može izazvati ubrzaniju degradaciju eDNA. Bitno je i da uzorak bude reprezentativan za taj okoliš. Također, iako mislimo kako smo daleko napredovali u analizama genoma organizama, baze podataka o genomu svih živih bića su daleko od potpunih. To nije čudno jer je primarni fokus čovjeka usmjeren na znanja o vlastitom genomu, genomu patogena, uzgojnih kultura i životinja. Stoga je moguće da i danas otkrivamo nove vrste, pogotovo ako se radi o mikroorganizmima. S druge pak strane, popunjavanje ovih baza podataka kao i stvaranje novih na temelju eDNA olakšava praćenje kretanja populacije nekih vrsta na globalnoj razini kroz internacionalnu suradnju što je bitno za praćenje migratornih vrsta. Na temelju eDNA također još nije moguće odrediti broj jedinki u staništu te će za takva istraživanja i dalje biti terenski rad.

Ipak analiza eDNA je bila transformativna za izučavanje bioraznolikosti jer je jeftinija, sveobuhvatnija a opet manje invazivna budući da nije potrebno loviti jedinke. Uspoređivanjem sastava organizama nekog ekosustava s njegovim kemijskim i fizikalnim parametrima možemo utvrditi njihov optimalni raspon te možda i rekonstruirati uvjete u okolišu koji bi bili povoljniji za održavanje ugroženih vrsta. To je važno za ekosustave oko umjetnih struktura koje unosimo u prirodu poput naftnih platformi ili vjetroelektrana.

Koliko je primjena eDNA pojeftinila istraživanja bioraznolikosti najbolje ocrtava primjer istraživanja farme vjetroelektrana na Sjevernom moru koje je klasičnim dvogodišnjim monitoring programom koštalo oko 150 tisuća funti a svega nekoliko godina kasnije postignuta je gotovo ista razina podataka (identificirano je oko 70% vrsti riba iz prethodnog istraživanja) samo na temelju 3 prikupljena uzorka vode čija analiza je stajala oko 600 funti.

Jedan od kurioziteta je da je eDNA također korištena u popularne Nessie iz Loch Nessa. Naravno Nessie je poslužila samo kao mamac za skretanje pozornosti na važnost primjene ove metode u analizi bioraznolikosti i nije potvrđena njena prisutnost.

Uzimanje uzoraka iz Loch Nessa. (Kieran Hennigan / CC BY-SA 1.0)

Raznolikost života na svijetu je ogromna i procjenjuje se da negdje između 80%- 90% vrsta na našem planetu još nije ni otkriveno. Napredak u korištenju eDNA još ne znači da je potreba za terenskim radom u potpunosti eliminirana, no zapravo je sveden na uzimanje uzoraka te ne zahtijeva dugotrajniji boravak na lokaciji. To ne znači da će znanstvenici ostati bez posla već će se preseliti u udobnost bioiformatičkih laboratorija gdje će još dugo raditi na identifikaciji genoma nepoznatih ili nesekvenciranih vrsta.

• Literatura

1) Ravindran S (2019). Turning discarded DNA into ecology gold. Nature 570: 543-545

2) Bell KL, Campos M, Hoffmann BD, Encinas-Viso F, Hunter GC, Webber BL. Environmental DNA methods for biosecurity and invasion biology in terrestrial ecosystems: Progress, pitfalls, and prospects. Sci Total Environ. 2024;926:171810.

3) Lu S, Zeng H, Xiong F, Yao M, He S. Advances in environmental DNA monitoring: standardization, automation, and emerging technologies in aquatic ecosystems ( u tisku). Sci China Life Sci. 2024

4) Veilleux HD, Misutka MD, Glover CN. Environmental DNA and environmental RNA: Current and prospective applications for biological monitoring. Sci Total Environ. 2021;782:146891.

Članak je izmijenjen 26. travnja 2024. U prvoj verziji članka Cryptobranchus alleganiensis je netočno naveden kao gušter.