Tajna pseudogena. Nisu to otpatci. U prirodi ipak sve ima svoju svrhu. Na žalost, neke su funkcije pseudogena nepovoljne, pomažu napredovanje tumora

Pseudogeni mogu biti korisni i u utvrđivanju kada je neki gen nastao ili nestao, na sličan način na koji paleontolozima koriste fosili u izučavanju nastanka i nestanka nekih vrsta, piše Tamara Čačev. Izučavanje pseudogena primata u odnosu na pseudogene miša, štakora, psa ili krave pokazuje kako su svi potekli od zajedničkog pretka, a kako se vrijeme kada je neka promjena u pseudogenu nastala može izračunati, možemo iz tog podatka doći i do trenutka kada su se pojedine vrste odvojile u zasebne evolucijske smjerove

• dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković

Kada sam krenula na studij molekularne biologije imala sam približnu sliku čime bih se željela baviti. No, kako to biva kad se studira, dok se dođe do toga što nekoga zanima prođe pola fakulteta, te se prije mora savladati i puno temeljnih principa. Te fundamentalne stvari su ponekad apstraktne i možda dosadnjikave, ali na kraju ipak korisne. Druga interesantna spoznaja, za koju je trebalo napraviti vremenski odmak od studija kako bi se osjetila na vlastitoj koži, jest eksplozivni razvoj tehnologije koja je omogućila generiranje iznimnih količina podataka koji su pak doveli do niza preokreta u razumijevanju kako život funkcionira na molekularnoj razini. Stoga sam ovaj tekst odlučila posvetiti temi pseudogena koji su me još na studiju zaintrigirali, no tada se o njima nije puno znalo i nekako su bili gurnuti na margine istraživanja. Danas se može reći kako se paradigma drastično promijenila i ono što je možda jedna od ljepših stvari u znanosti, kad srušite jednu domino pločicu pokrene se niz drugih, te se od malih pojedinačnih otkrića odjednom iskristalizira nova slika kako funkcionira priroda stvari (do sljedećeg domina).

Svi znamo da postoje geni, pa što su onda  pseudogeni?  Već se etimološki može zaključiti da se radi o nečem što nalikuje na gen ali to nije. To je najjednostavniji opis sljedova u molekuli DNA nekog organizma koji imaju sličnost a često su i nastali od nekog gena, no ne mogu raditi to što radi gen kome nalikuju. Razlike u odnosu na matični gen nisu velike ali su dovoljne da pseudokopija nije funkcionalna. Stoga su se pseudogeni prvotno smatrali „oštećenim“ verzijama gena, svojevrsnim evolucijskim otpadom ili kako su ih još nazivali „molekularnim fosilima“  koji su se kroz vrijeme nataložili u genomu nekog organizma. No, postavljalo se pitanje zašto ta nefunkcionalna DNA, kako se onda mislilo, perzistira u genomu ako je beskorisna. Danas, najnovija otkrića pokazuju kako pseudogeni možda nemaju funkcionalnosti gena kojima nalikuju, ali zato imaju niz drugih uloga koje su bitne za normalno funkcioniranje organizma, nažalost i za nastanak i napredovanje nekih bolesti poput tumora.

Krenimo redom. Prvi pseudogen otkriven je daleke 1977. u genomu afričke žabe Xenopus laevis. Dr.  Jacq i suradnici su istražujući jedan gen bitan u jajnim stanicama ove žabe otkrili kako je on u genomu prisutan u nekoliko uzastopnih ponavljajućih kopija te su tim kopijama dali ime „pseudogeni“.¹ One koje interesira kao se uopće netko sjeti istraživati genom afričke žabe upućujem na moj prethodni tekst o modelnim organizmima, a ovdje ću izdvojiti da se radi o žabi koja se koristila za istraživanje i razvoj prvih testova za trudnoću koji su bili u upotrebi od tridesetih do šezdesetih godina prošlog stoljeća, a razvili su ih dvojica studenata sa Sveučilišta u Cape Townu.²

Drugi značajan događaj u istraživanju pseudogena  uslijedio je s priličnim vremenskim odmakom, 2003. kada je otkriveno da pseudogen Makorin1-p1 u genomu miša kontrolira ekspresiju „pravog“ Makorin1 gena. Dakle, pseudogen nije beskorisna oštećena kopija nego bitan čimbenik koji utječe na funkciju gena kojem nalikuje. Taj je nalaz bacio novo svjetlo na potencijalnu ulogu pseudogena čime se pokrenula lavina njihovog intenzivnijeg istraživanja i oni su postali gotovo „hot topic“ u molekularnoj biologiji. Od tada su identificirani u genomima raznih vrsta sisavaca, biljaka, insekata, bakterija i drugih organizama koji su u evolucijskom smislu vrlo udaljeni jedni od drugih, no svejedno ih je karakterizirala univerzalna prisutnost pseudogena.

Zašto se to nije otkrilo i ranije, zašto je na ova otkrića trebalo čekati tridesetak godina? Stvar je kao i uvijek u napretku tehnologije, u ovom slučaju tehnologije sekvencioniranja genoma. Kako se radilo o minimalnim razlikama između gena i pseudogena, zbog greški u starijim načinima sekvencioniranja teško je bilo razlučiti te dvije sekvence DNA. Također, pseudogeni su bili smetnja istraživanjima „pravih“ gena te su se tražili načini kako da se izbjegne analiza tih, kako se smatralo, krivih i beskorisnih sekvenci. Stoga je istraživanje pseudogena do razvoja novih pristupa sekvencioniranju genoma i bioinfoirmatičke obrade dobivenih podataka bilo otežano, a mišljenje kako su to nebitni dijelovi DNA također nije pomoglo.

U genomu čovjeka ima vjerojatno oko 11 000 pseudogena što je priličan broj budući da se smatra kako u genomu čovjeka ima oko 20 000 gena koji kodiraju za proteine.³  No, svega 10 % gena čovjeka ima korespondirajući pseudogen, pa se može zaključiti kako neki geni imaju i nekoliko pseudogena. Geni koji najčešće imaju svoje pseudogene pripadaju iznimno aktivnim skupinama, primjerice 20% svih pseudogena čovjeka čine pseudogeni za 80-tak proteina koji tvore ribosom, esencijalni stanični organel za proizvodnju proteina, prisutan od najranijih oblika života.⁴

Danas možemo reći kako se učvrstila ideja da pseugodeni sudjeluju u finoj regulaciji funkcije gena kojima nalikuju. Kako se odvija ta kontrola „pravih gena“ od pseudogena? Opisano je nekoliko molekularnih mehanizmama, a kao ilustraciju o koliko se kompleksnim procesima radi ukratko ću opisati mehanizam koji koristi put RNA interferencije  (engl. RNA interference pathway).  U slučaju ovakvog tipa regulacije pseudogen kodira kratke molekule RNA koje su komplementarne sekvenci mRNA koju kodira pravi gen te se tako te dvije RNA „zalijepe“ jedna na drugu što onemogućuje daljnju funkciju „prave“ RNA. Postoje naravno i drugi, kompleksniji mehanizmi u koje neću ulaziti.

Danas pseudogene dijelimo na dva osnovna tipa i to prema tipu gena od kojih su nastali. Neki pseudogeni nastaju od gena koji kodiraju za proteine dok drugi nastaju od gena koji kodiraju za RNA molekule.  Njihova prepoznatljiva karakteristika, bez obzira na tip kojem pripadaju, jest da im je sekvenca uglavnom minimalno izmijenjena u odnosu na matični gen ali i to je dovoljno da pseudogeni ne mogu izvršavati njegovu funkciju.

Kako pseudogeni nastaju? Do danas opisani mehanizmi nastanka pseudogena uglavnom se temelje na duplikaciji postojećeg gena, što je nekako samorazumljivo i tada se najčešće nalaze u blizini gena od kojeg su nastali.  Drugi način, koji je i češći u genomima sisavaca i posebno čovjeka, jest da se radi o pseudogenima nastalim mehanizmima retrotranspozonskog „skakanja sekvenci“ po genomu.

Centralna dogma molekularne biologije jest da gen kodira za svoju RNA koja onda daje funkcionalni protein. Naravno, ova dogma ima i svojih (sve više) izuzetaka. Jedan od njih je i prethodno spomenuto „skakanje“ po genomu koje nastaje kada gen kodira svoju RNA koja se onda prekodira natrag u DNA (dakle sekvenca opet izgleda kao početni gen) i integrira u genom na nekom novom mjestu dalje od matičnog gena.

https://en.wikipedia.org/wiki/Pseudogene

Danas se smatra da, kroz duži evolucijski period, novonastali pseudogen koji možda u početku stvarno i nema neku funkciju, može steći nove funkcije u regulaciji svog matičnog gena ali i drugih gena koji su s matičnim genom u interakciji. Na taj način pseudogen perzistira u genomu ukoliko je u  evolucijskom smislu organizam s pseugodenom u prednosti pred onima koji nemaju tu vrstu dograđene genske regulacije. Po današnjim spoznajama to je i razlog zašto u genomima različitih organizama  nalazimo veliki  broj pseudogena čiju ulogu još nismo odgonetnuli.

Dodatno, manji broj pseudogena (oko 8 % kod čovjeka ili  čak do 20% kod biljke Arabidopsis) i dalje ima ili je ponovno stekao sposobnost kodiranja proteina. Tako nastaju tzv. pseudogeni proteini koji oponašaju ili ometaju funkciju proteina nastalih od matičnog gena kao što je to slučaj u tumorima. Ipak, kako se ti pseudogeni proteini pojavljuju na neuobičajenim mjestima i vremenu u organizmu, naš ih imunološki sustav može prepoznati kao „krive“ tako da oni postaju nove potencijalne mete za razvoj antitumorskih terapija.

Pseudogeni mogu i na druge načine djelovati kao onkogeni ili mogu poništiti aktivnost tumor-supresorskih gena. Matični gen i pseudogen mogu izmjenjivati dijelove svoje sekvence pa se npr. pokazalo da gen BRCA1 može preuzeti dio sekvence svojeg pseudogena PsiBRCA1 i izgubiti funkciju koja je bitna za sprečavanje tumora dojke. Ovo je ujedno jedan od novijih utvrđenih mehanizama kako se ovaj gen inaktivira uz već dobro poznate mutacije. Nastanak i napredovanje tumora možemo shvatiti i kao svojevrsnu ubrzanu evoluciju stanice koja se iz normalnog funkcioniranja otela regulatornim mehanizmima te se nekontrolirano dijeli i skuplja mutacije koje joj daju prednost pred okolnim normalnim stanicama. Stoga ne začuđuje kako se u tumorima mogu pronaći novonastali pseudogeni kojih nema u pripadajućem normalnom tkivu.

Sekvencioniranje genoma čovjeka pokazalo je da imamo manje gena koji kodiraju za proteine u odnosu na, primjerice, neke biljke. Kako se broj protein-kodirajućih gena smatrao pokazateljem kompleksnosti nekog organizma, postavljalo se pitanje kako je to moguće?  Odgovor jest da kompleksnost nekog organizma nije rezultat samo broja protein-kodirajućih gena već i složenih mehanizama njihove regulacije. Čovjek, odnosno da budemo precizniji, njegove stanice imaju nevjerojatno kompleksne mehanizme regulacije funkcije gena s čitavom vojskom posredničkih molekula poput miRNA, ncRNA i sličnih koje su otkrivene unatrag nekoliko godina, a dio njih nastaje i kao rezultat djelovana pseudogena.

Pseudogeni mogu biti korisni i u utvrđivanju kada je neki gen nastao ili nestao, na sličan način na koji paleontolozima koriste fosili u izučavanju nastanka i nestanka nekih vrsta. Primjerice gen za citokrom c (iznimno važan za prijenos elektrona i pretvaranja energije u stanicama) čovjeka ima 47 poznatih pseudogena te se njihovom usporedbom s takvim genima ostalih primata mogu izvesti filogenetski zaključci o evoluciji čovjeka. Izučavanje pseudogena primata u odnosu na pseudogene miša, štakora, psa ili krave pokazuje kako su svi potekli od zajedničkog pretka, a kako se vrijeme kada je neka promjena u pseudogenu nastala može izračunati, možemo iz tog podatka doći i do trenutka kada su se pojedine vrste odvojile u zasebne evolucijske smjerove.

Interesantan, noviji podatak, koji također dugujemo razvoju bioinformatičkih analiza genoma, jest da su nedavno otkriveni i pseudogeni čija je sekvenca prilično divergirala od matičnog gena te se oni mogu detektirati samo pomoću posebnih računalnih algoritama.

Zaključno se može reći kako iz svega prije navedenog proizlazi kako pseudogeni nisu samo molekularni fosili i genomsko smeće već da imaju važne uloge u finoj regulaciji molekularnih mehanizama unutar stanica. Na njih  možemo gledati i kao na svojevrsni bazen genetičkih varijacija koje se po potrebi, u slučaju evolucijskog pritiska, mogu iskoristiti za stvaranje novih molekularnih funkcionalnih/regulatornih sklopova u stanici. Koliko će se novih pseudogena otkriti pokazat će budućnost, no sigurno je da će se njihova uloga istraživati još dugi niz godina.

1) Jacq C, Miller JR, Brownlee GG (1977). “A pseudogene structure in 5S DNA of Xenopus laevis”. Cell. 12 (1): 109–20.

2)  Xenopus laevis, ttps://en.wikipedia.org/wiki/African_clawed_frog#Use_in_research

3) ENCODE Project. Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the  human genome. Nature 2012;489:57–74.

4) Poliseno L. (2012) Pseudogenes: Newly Discovered Players in Human Cancer. Science Signaling (5 (242), re5