Priča o otkriću. Bolest kojoj je uzročnik virus, liječi se iako za nju još nema cjepiva. Hepatitis C

Dodjela ovogodišnje Nobelove nagrade za medicinu istraživačima virusa hepatitisa C čini se nekako prirodnom s obzirom na korona-okolnosti. Uzbudljiva priča o identifikaciji 'podmuklog' virusa, najzloćudnijeg od uzročnika virusnih upala jetre, koji predstavlja globalnu zdravstvenu prijetnju. Ipak, postoji svjetlo na kraju tunela. Kako je u procesu koji je trajao 40 -tak godina stvorena terapija koja omogućuje izlječenje i do 95% oboljelih, piše Tamara Čačev

• dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković. Čačev je također članica Savjeta Ideje.hr

U jeku pandemije COVID-19 mnogima je promaklo tko su ovogodišnji laureati Nobelove nagrade za fiziologiju ili medicinu. Dodijeljena je za otkirće virusa hepatitisa C trojici znanstvenika Harveyu J. Alteru, Michaelu Houghtonu i Charlesu M. Riceu. Čini se nekako prikladnim s obzirom na sveprisutan interes za virologiju i infektivne bolesti.

Svima su nam vjerojatno poznati hepatitis A koji dolazi u akutnom obliku bolesti koju nazivamo žutica a prenosi se putem zagađene vode i hrane odnosno u kontaktu s osobama zaraženim ovom bolešću ‘prljavih ruku’. Danas znamo da tu bolest izazvaju RNA virusi iz obitelji Picornaviridae (Hepatitis virus A) ili iz obitelji Hepeviridae (Hepatitis virus E) .

Hepatitis B prenosi se putem tjelesnih tekućina te se zaraza širi putem inficiranih igli ili spolnim putem. Posebno su zarazi izložene osobe koje se u poslu susreću s krvi poput zdravstvenih radnika, a u rizičnoj su skupini i intravenski ovisnici o drogama. Do 1960-tih transfuzije krvi bile su svojevrstan ‘ruski rulet’, budući da je i do 30% osoba koje je moralo primiti transfuzije, primjerice tijekom operativnog zahvata, kasnije razvilo kronični hepatitis. Tijekom 60-tih,  Baruch Blumberg identificirao je virus hepatitisa B kao uzročnika ove bolesti jetre koji se prenosi putem krvi. Radi se o DNA virusu iz obitelji Hepadna virusa. Kada je bio poznat uzročnik bilo je moguće napraviti i testove za njegovu detekciju kao i cjepivo, što se i dogodilo. Stoga  je 1976. godine Blumberg za otkriće virusa hepatitisa B dobio Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu zajedno s Danielom C. Gajdusekom koji je otkrio prvu prionsku bolest-kuru. Hepatitis B u manjem broju oboljelih (5-10%) može prerasti u kroničnu bolest. Tek razvojem molekularne virologije otkriven je virus hepatitisa D, RNA virus iz obitelji Deltaviridae, koji dolazi kao popratna infekcija virusom tipa B, a u ovom je otkriću sudjelovao i Houghton, ovogodišnji laureat.

No vratimo se hepatitisu C.  Prenosi na slično kao i hepatitis B, ali su posljedice infekcije tim virusom puno ozbiljnije a bolest u puno većem broju oboljelih prelazi u kronični oblik. I dok za hepatitis A i B postoji cjepivo, unatoč brojnim istraživanjima još ne postoji cjepivo za ovaj najopasniji tip virusa, hepatitis C. Dio razloga leži u njegovoj izrazitoj mutabilnosti te većem broju varijanti ovog virusa (7 genotipova i brojni podtipovi).

Hepatitis C je najzloćudniji od virusnih uzročnika upale jetre i najznačanjiji patogen koji se prenosi krvlju te se smatra kako je oko 3% svjetske populacije zaraženo ovim virusom (Slika 1). Prema procjenama Svjetske zdravstvene organizacije u svijetu oko 1% stanovništva boluje od kroničnog oblika hepatitisa C a oko 400 tisuća ljudi godišnje umire uslijed ciroze ili karcinoma jetre koji nastaju kao dugotrajna posljedica ove infekcije. U Hrvatskoj je na sreću situacija značajno bolja zbog dobre zdravstvene skrbi kao i neosporno boljih životnih uvjeta u odnosu na siromašnije i mnogoljudnije zemlje svijeta. Općenito Sjeverna Amerika, Europa i Australija imaju nižu prevalenciju, dok azijske i afričke zemlje prednjače po udjelu zaraženih.

Zašto je infekcija hepatitisom C puno opasnija u odnosu na druge hepatitis viruse? Radi se o ‘podmuklom’ virusu koji ne mora izazvati simptome u oboljelog dugi niz godina prije pojave prvih ozbiljnih komplikacija. Opasnost leži u prelasku u kroničnost do čega dolazi u oko 80% oboljelih, a kronični oblici bolesti kroz nekoliko desetljeća mogu izazvati cirozu i hepatocelularni karcinom. Radi se dakle o globalnoj zdravstvenoj prijetnji od koje godišnje umire veliki broj ljudi.

Slika 1. Prevalencija zaraze virusom hepatitis C u svijetu preuzeto s https://www.cdc.gov/travel-static/yellowbook/2020/map_4-05.pdf

Nekako u isto vrijeme s  identifikacijom virusa hepatitisa B, ovogodišnji dobitnik Nobelove nagrade  Alter radio je u banci krvi  te je pri US National Institutes of Health istraživao pojavu hepatitisa kod osoba koje su primile transfuziju. Ubrzo je uočeno kako unatoč testiranju na tada novootkriveni virus hepatitisa B, još značajan broj osoba koje su primile transfuziju krvi obolijeva od kroničnog hepatitisa. U to vrijeme se kroz druga istraživanja iskristaliziralo kako hepatitis A nikako ne može biti uzročnik kroničnog hepatitisa. Stoga je postalo jasno kako mora postojati neki nepoznati infektivni agens koji izaziva ovu bolest a ne radi se o dva prije opisana virusa.  U dodatnim eksperimentima pokazano je kako krv oboljelih od ovog tipa hepatitisa može izazvati bolest u čimpanzi te kako se mora raditi o virusnom uzročniku koji izaziva tzv. ‘non-A, non-B’ tip hepatitisa.

Unatoč tome što je bilo jasno kako se radi o virusnom uzročniku, svi pokušaji njegove identifikacije bili su bezuspješni gotovo cijelo desetljeće sve dok Michael Houghton, drugi ovogodišnji laureat nije u svojim pionirskim istraživanjima identificirao sekvencu novog virusa te ju objavio 1989. godine. Danas u eri sekvenciranja čitavog genoma organizama možda je teško shvatiti kako se radilo o ekstremno zahtjevnom poduhvatu s obzirom na tadašnje mogućnosti molekularne biologije. Ipak on i suradnici osmislili su genijalan plan kako da izoliraju segmente viralnog genoma iz krvi zaraženih čimpanzi. Houghton i suradnici izolirali su fragmente nukleinskih kiselina (RNA) iz krvi zaraženih čimpanzi u nadi da se među njima nalazi i genom nepoznatog virusa i iz njih napravili biblioteku fragmenata koristeći bakteriofage, viruse koji napadaju bakterije, kako bi dobili klonove sa različitim ‘komadićima’ nukleinskih kiselina. Tim su bakteriofagima zarazili bakterije koje su zatim ispoljavale antigene nepoznatog virusa. Korištenjem seruma oboljelih od non-A, non B hepatitisa za koji se pretpostavljalo da sadrži protutijela na nepoznati virus ‘pecali’ su klonove bakterija koji su u kontaktu sa serumom dali reakciju. Na taj su način pretražili milijune bakterijskih kolonija i konačno pronašli jednu u kojoj nije bilo ni dijelova sekvence genoma čovjeka niti čimpanze. Zamislimo to kao da imamo neki tekst na papiru i da smo stranicu razderali na komadiće i zatim smo pojedine komadiće te stranice upakirali u  paketiće i sad moramo identificirati u kojem od njih se nalazi onaj dio teksta u kojem se nalazi magična riječ – genom virusa. Naravno, pri tome ne znamo što tražimo ali znamo kakvu reakciju taj paketić može izazvati kada na njega naleti ‘magični’ detektor iz krvi oboljelih. U ovom slučaju ‘magični’ detektor se nalazi u serumu oboljelih od ‘non-A, non-B’ hepatitisa u obliku protutijela na uzročnik bolesti. Nakon niza takvih eksperimentata virus je konačno izoliran, utvrđeno je da se radi o RNA virusu koji pripada obitelji Flavivirusa  i nazvan je virus hepatitisa C (Slika 2).

Na konferenciji za medije uz objavu imena laureata, Alter je komentirajući otkriće kolege Houghtona posumnjao da bi danas istraživači imali dovoljno dugoročnog financiranja da se šest godina, koliko je trebalo da se ovaj virus klonira, bave ovim problemom bez neposrednog vidljivog rezultata.

Slika 2. Model virusa hepatitis C.  Na površini virusne čestice nalazi se ovojnica od lipoproteina LDL i VLDL. Iz nje izviruju poput šiljaka heterodimeri glikoproteina E1 i E2. U unutrašnjosti virusne čestice nalazi se genom virusa a u ovom slučaju riječ je o jednolančanoj RNA molekuli. Preuzeto iz World J Hepatol. Feb 27, 2018; 10(2): 186-212; doi: 10.4254/wjh.v10.i2.186

No, postavilo se pitanje je li ovaj novi virus jedini uzročnik ‘non-A, non-B’ hepatitisa ili možda postoje i neki kofaktori u infekciji. Kako bi se nepobitno pokazala uzročno-posljedična veza između virusa i bolesti trebalo je izolirati virus koji može izazvati kliničku manifestaciju bolesti sve do kroničnih oštećenja jetre kao i pokazati da taj virus uistinu dugo vremena perzistira u organizmu oboljelog.

Devedesetih godina prošlog stoljeća Charles M. Rice radio je na istraživanju nekarakterizirane regije u genomu ovog virusa za koju je pretpostavio da ima ulogu u umnažanju virusa. Iskoristio je ovu regiju te napravio virusni konstrukt koji je injecirao u jetru čimpanzi te pratio pristunost dokaza replikacije virusa. Nije dobio takvu potvrdu jer novih čestica virusa nije bilo u krvi čimpanzi. Ali,  uočio je kako različitim izolatima genoma virusa postoje varijacije (mutacije) koje utječu na sposobnost virusne replikacije. Metodama genetičkog inženjeringa, Rice i suradnici napravili su varijantu virusa koji u replikacijski bitnoj regiji nije imao inaktivirajućih mutacija. Kada je ovako modificirani virus injeciran u jetru čimpanzi pokazalo se kako je virus prisutan u krvi a životinje manifestiraju patološke promjene koje su vidljive kod ljudi s kroničnim hepatitisom. To je bio konačni dokaz da funkcionalni oblik virusa hepatitisa C samostalno može izazvati bolest hepatitis i objavljen je ne tako davne 1997. godine.

Slika 3. Genom virusa hepatitisa C. Preuzeto iz World J Hepatol. Feb 27, 2018; 10(2): 186-212; doi: 10.4254/wjh.v10.i2.186

Genom virusa hepatitisa C je veličine oko 9600 nukleotida i radi se o jednolančanoj molekuli RNA. Danas znamo da kodira za jedinstveni polipeptidni prekursorski lanac iz kojeg se kasnije izrezuju sve proteinske komponente potrebne za izgradnju virusne čestice kao i za samo funkcioniranje virusa (slika 3).

Koji je značaj otkrivanja virusa hepatitisa C kao uzročnika kroničnog hepatitisa? Kada imamo poznatog uzročnika neke bolesti sva se istraživanja usmjeravaju ka pronalasku preciznih testova, lijekova i cjepiva kao što možemo svjedočiti u slučaju aktualne pandemije. Zahvaljujući otkriću ovog trećeg i najzlokobnijeg uzročnika hepatitisa danas imamo testove kojima se on može detektirati te više nema opasnosti zaraze putem transfuzije ili prilikom transplantacije organa. Cjepiva nažalost još nemamo, iz prije opisanih razloga.

Ipak postoji svjetlo na kraju tunela. Razvojem novih pametnih lijekova koji ciljano napadaju virus danas je izlječenje kroničnog hepatitisa C moguće u gotovo 95% oboljelih. Do ove, možemo slobodno reći revolucije u terapiji hepatitisa C došlo se u proteklom desetljeću kada su napravljeni ogromni iskoraci na polju određivanja molekulanih meta za razvoj ciljanih lijekova protiv ove bolesti. Direktnim ciljanjem viralnih proteina poput NS3/4A proteaze, NS5B polimeraze i regulatornog replikacijskog proteina NS5A različitim inhibitorima kojima se djeluje na pojedine faze životnog cikusa virusa od 2010. godine na ovamo postignute su visoke stope izlječenja.

Često se u kontekstu revolucionarnih biomedicinskih izuma spominje cijepljenje i antibiotici kao tekovine 20. -tog stoljeća, no možemo reći da će 21. stoljeće biti stoljeće antiviralnih lijekova i to upravo zahvaljujući antiviralnim lijekovima za hepatitis C ali i za HIV koji se pretvorio u kroničnu bolest. Svjetska zdravstvena organizacija postavila je ambiciozan cilj iskorijeniti virus hepatitisa C do 2030. godine, no to će, smatra se, biti teško bez pronalaska cjepiva i konsenzusa o dostupnosti modernih ciljanih antiviralnih lijekova kao jednog od prioriteta čovječanstva. Budućnost ipak zgleda optimistično te postoji mogućnost da kroz međunarodne napore u području testiranja i dostupnosti antiviralnih lijekova uspijemo  u ovom stoljeću iskorijeniti ovu bolest.

• O laureatima

Harvey J. Alter (1935., New York) je internist koji od 1961.g s kraćim prekidima radi na National Institutes of Health.

Michael Houghton (1949.)  je Britanac koji je 1977.g doktorirao na King’s College London a nagrađen je za istraživanja koja je provodio dok je bio zaposlen u Chiron Corporation u Kaliforniji. Kasnije se preselio u Kanadu gdje je profesor virologije na Sveučilištu Alberta. Medijsku pozornost izazvao je 2013. g. kada je odbio primiti nagradu od 100 000  dolara fondacije Gairdner budući da njome nisu bili nagrađeni i njegovi kolege sa kojima je radio upravo na otkriću hepatitisa C.

Charles M. Rice rođen je 1952. g u Sacramentu i doktorirao je 1981.g na California Institute of Technology, karijeru je gradio na nizu sveučilišta u SAD i sada radi kao profesor pri Sveučilištu Rockefeller gdje je do prije dvije godine i vodio centar za istraživanje hepatitisa C.

• Publikacije koje su bile temelj za otkrića opisana u tekstu

Alter HJ, Holland PV, Purcell RH, Lander JJ, Feinstone SM, Morrow AG, Schmidt PJ. Posttransfusion hepatitis after exclusion of commercial and hepatitis-B antigen-positive donors. Ann Intern Med. 1972; 77:691-699.

Feinstone SM, Kapikian AZ, Purcell RH, Alter HJ, Holland PV. Transfusion-associated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B. N Engl J Med. 1975; 292:767-770.

Alter HJ, Holland PV, Morrow AG, Purcell RH, Feinstone SM, Moritsugu Y. Clinical and serological analysis of transfusion-associated hepatitis. Lancet. 1975; 2:838-841.

Alter HJ, Purcell RH, Holland PV, Popper H. Transmissible agent in non-A, non-B hepatitis. Lancet. 1978; 1:459-463.

Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 1989; 244:359-362.

Kuo G., Choo QL, Alter HJ, Gitnick GL, Redeker AG, Purcell RH, Miyamura T, Dienstag JL, Alter CE, Stevens CE, Tegtmeier GE, Bonino F, Colombo M, Lee WS, Kuo C., Berger K, Shuster JR, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis. Science. 1989; 244:362-364.

Kolykhalov AA, Agapov EV, Blight KJ, Mihalik K, Feinstone SM, Rice CM. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 1997; 277:570-574