Test koji dijagnosticira COVID-19 u 15 minuta, za aerodrome i granice. Utjecaj testiranja na kontrolu pandemije

U povodu vijesti da je u SAD odobren dosad najjednostavniji, najjeftiniji i najbrži test na SARS-CoV-2 Tamara Čačev piše o pouzdanosti i vrstama testova. Ima li smisla testirati i one kod kojih nema nikakvih medicinskih indikacija o zarazi, što se time dobiva?

• Naslovna ilustracija: uzimanje uzorka za testiranje na Covid-19 (Total Croatia News)

• dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković. Čačev je također članica Savjeta Ideje.hr

Molekularna mikrobiologija, molekularna dijagnostika, iskreno mislim da ni prilično molekularnih biologa nije bilo previše zainteresirano za ta područja naše struke jer se donedavno radilo o relativno malom spektru mogućnosti testiranja, rutinskom radu u kliničkim laboratorijima i odgovornosti da u potpunosti stojiš iza rezultata rada jer o tome ovisi sudbina nekog pojedinca. Naravno da ovaj tekst pišem u svjetlu iznimne zainteresiranosti za molekularna testiranja na infekciju virusom SARS-CoV-2, no jasno je kako su takva testiranja potrebna i u veterini i u agronomiji. Možda je takav interes javnosti izazvalo jedino testiranje na pristunost GMO organizama u hrani, iako tada fokus nije bio na samom testu, nego na famoznoj granici detekcije. Iskreno, taj hype oko deklariranja non-GMO nije nikad bio jasan, no očito u marketingu hrane pali. Danas imamo raznih proizvoda koji se deklariraju kao no-GMO iako ne postoji ni razlog zašto bi i sadržavali GMO, nastranu što je to i tehološki puno zahtjevnija proizvodnja. To vam je znate slično, kao kad kažu da kremu za tijelo nisu testirali na životinjama. Naravno da nisu kad su svi sastojci odavno poznati i u prethodnoj upotrebi već desetljećima.

No vratimo se molekualrnoj dijagnostici u infektologiji, testiranju na prisutnost ili infekciju virusom SARS-Cov-2. Ovih dana možemo svjedočiti nikad bržem razvoju ovih testova te je neposredni povod vijest objavljena u časopisu Science kako je u SAD odobren dosad najjednostavniji, najjeftiniji i najbrži test na SARS-CoV-2.¹

Najprije treba reći kako se testovi razlikuju po tome što nam je cilj saznati, odnosno želimo li vidjeti da je neka osoba sada ili u prošlosti bila u kontaktu s virusom. I jedno i drugo ima svoju vrijednost. Za kliničke je aplikacije najvažnije saznati je li osoba trenutno pozitivna na virus, no interesantno je znati i u kojem postotku je opća populacija bila u kontaktu s virusom. To su testovi kojima se procjenjuje toliko spominjani imunitet krda. Na razini pojedinca, indikacija da je osoba bila u prošlosti u kontaktu s virusom i možda čak asimptomatski razvila imunosni odgovor na virus je od koristi tom pojedincu kao eventualna potvrda da zna na čemu je, iako u principu to još nije garancija da je razvio adekvatni imunosni odbrambeni odgovor odnosno da se u dužem vremenskom periodu, taj imunitet neće izgubiti.

U tehničkom smislu postoje dva osnovna tipa testa ovisno o tome što se u određenom uzorku ispituje: pristunost samog virusa ili protutijela koja su nastala kao odgovor na infekciju SARS-CoV-2.

Direktno dokazivanje virusnog genoma je zlatni standard ovog tipa dijagnostike jer otkriva prisutnost virusa i prije vanjske manifestacije kliničkih simptoma te je stoga korisno za rano detektiranje akutno zaraženih osoba. U ovom tipu testiranja iz uzorka brisa nazofarinksa najprije se izdvaja virusni genom iz kojeg se zatim ciljano umnažaju određene regije (dijelovi koji kodiraju specifične proteine virusa N, E, S i RdRp) kako bi se specifično dokazala prisutnost upravo tog virusa.² Kako se radi o virusu čiji je genom zapisan u RNA molekuli, najprije se provodi proces reverzne transkripcije kojom se RNA prevodi u molekule DNA. Zatim se tako dobivena DNA umnaža reakcijom uz pomoć enzima polimeraze (engl. PCR, polymerase chain reaction). To se umnažanje provodi stoga što je količina nukleinske kiseline virusa u početnom uzorku mala i nije ju moguće direktno detektirati. Takvim načinom se  od male količine RNA u uzorku mogu dobiti dovoljne količine molekule DNA koje se mogu detektirati.  Danas se umnažanje najčešće provodi metodom koju nazivamo kvantitativni PCR, na posebnom tipu uređaja. Za pripremu i analizu uzoraka koriste se certificirani setovi reagensa za koje proizvođači garantiraju točnost i reproducibilnost. Konačni rezultat analiziraju molekularni biolozi koji procjenjuju je li reakcija testa uspjela, da li se radi o granično pozitivnom testu ili je zbog nekog drugog razloga možda potrebno molekularnu analizu ponoviti. Ovako napisano vjerojatno je nekome izvan struke teško predočiti o čemu se tu točno radi pa preporučam ovaj video u kojem su ovi postupci animirani radi lakšeg razumijevanja.

U drugom videu jedna je od jednostavnijih verzija ovog testiranja koja prikazuje što točno molekularni biolozi rade u laboratoriju budući da  je neko opće mišljenje da se radi o testovima tipa krvne slike u kojima samo neki stroj izbaci rezultat. Zatim se postavljaju pitanja zašto to toliko traje, zašto se to ne radi na više mjesta i zašto to ne bi radio netko preko noći za to “priučen”.

U drugom tipu testova, tzv. serološkim testovima dokazujemo prisutnost protutijela koje je naš organizam razvio kao odgovor na infekciju. Stoga ih se kolokvijalno u engleskom jeziku naziva i antibody testovima kako bi ih razlikovali od tzv antigen testova o kojima će biti riječi kasnije. Ovi testovi temelje se na svojstvu našeg imunološkog sustava da reagira na virus proizvodnjom protutijela. U tom smislu se pokazalo kako su proteini spike (S) i proteini nukleokapside (N)  zasad oni koji izazivaju takav odgovor. Kako je vremenski tijek rasta i pada količine ovih protutijela poznat, a razvoj protutijela događa se u danima/tjednima nakon prvog kontakta s virusom, pozitivitet na ovakav tip testa ukazuje da je osoba prije nekog vremena bila u kontaktu s virusom te su protutijela koja su se razvila kao rezultat ovog kontakta još u krvi. Nedostatak ovakvog testa je to što se imunosni odgovor počinje razvijati kasnije u tijeku infekcije te su stoga ovi testovi nepogodni za ranu i akutnu detekciju zaraženih.

Većina testova kojima se detektiraju protutijela na SARS-CoV-2 temelji se na detekciji tzv. vezujućih protutijela. Radi se o onima koja se vežu na virusni protein i na taj način cijeli virus označe kao ‘problem’“ koji onda naš imunosni sustav počinje rješavati pri čemu je virusna čestica nakon takvog označavanja i dalje infektivna. No, postoje i tzv. neutralizirajuća protutijela koja se također vežu na virus te ga ujedno i neutraliziraju, odnosno on više nije prijetnja našem organizmu. Kako su rutinski testovi mahom temeljeni na analizi vezujućih protutijela iz njih ne možemo dobiti informaciju je li osoba razvila i neutralizirajuća protutijela koja je štite od ponovne infekcije. Načelno se može očekivati da su vezujuća protutijela u korelaciji s neutralizirajućim protutijelima no za SARS-CoV-2 još nemamo dovoljno podataka. Za druge SARS viruse pokazano je da neutralizirajuća protutijela ostaju aktivna od 2 do 6 godina, no pitanje je hoće li to tako biti i za ovaj virus. S druge strane, ne temelji se obrana organizma od patogena samo na protutijelima. Postoji još jedna grana imunosnog sustava koju nazivamo staničnom imunosti jer u njoj sudjeluju različite stanice imunološkog sustava. U toj grani obrane od patogena stvaraju se i tzv. memorijske T-stanice za koje se zna kako mogu puno dulje nositi informaciju o susretu i obrani od nekog patogena.

Danas na stranicama Svjetske zdravstvene organizacije postoje validirani protokoli za provođenje testiranja na SARS-CoV-2, a mnogi su proizvođači reagensa i opreme za molekularnu biologiju na tržište izbacili i gotove testove te instrumente čija je točnost i reproducibilnost potvrđena prethodnim testiranjima u samim tvrtkama.⁴ Bez obzira na to koriste li se tzv. home-made protokoli ili gotovi kitovi, još postoji šansa da test bude lažno negativan ili lažno pozitivan. Stoga se u same testove ugrađuju i elementi koji služe kao interna kontrola da je sa samim testom sve u redu. Ideal bi svakako bilo postići 100% točnost i reproducibilnost i to uz izrazitu osjetljivost testa, što znači da bi se i najmanje količine virusa mogle nedvojbeno detektirati svaki put u svakom uzorku. Takvih idealnih testova naravno nema, no približiti se točnosti od  97-99% još je dovoljno dobro.

Zašto se ponekad može javiti lažno pozitivan ili lažno negativan rezultat? Razloga je puno, od načina testiranja i internih svojstava testa odnosno reagensa i instrumenta koje koristimo u analizi pa do načina na koji je uzorak prikupljen, transportiran i pripremljen za analizu. Konačno, može ovisiti i o uzorku, u nekim slučajevima je virusa u uzorku naprosto premalo da ga se u trenutku testiranja može detektirati jer sve metode imaju svoj prag detekcije. Stoga ti ‘granični’ uzorci mogu biti proglašeni negativnima iako to zapravo nisu. Naravno, u tim graničnim uzorcima analiza se ponavlja kako bi se utvrdio konačni status uzorka. U lažno pozitivnim rezultatima testa može se dogoditi da dobijemo signal kao da je u uzorku prisutan virus, no to nije tako. Do toga može doći zbog kontaminacije u rukovanju uzorcima, nekih intrinzičkih karakteristika reagenasa koji se koriste a koji ponekad mogu dati nespecifičan pozitivni signal i slično.

Moguće je i da osoba na serološkom testu bude negativna a na PCR testu pozitivna. Do toga dolazi jer se radi o vrlo različitim metodama detekcije koje u uzorku utvrđuju druge molekularne targete iz dva različita izvora uzorka. Stoga je opet moguće da prvih dana infekcije u uzorku brisa postoji nukleinska kiselina virusa, a da naš organizam nije još razvio protutijela u krvi kao reakciju na taj virus. Naravno i ovdje može biti riječ o greškama u uzimanju samog uzorka, o činjenici da se jedna metoda temelji na brisevima nazofarinksa a druga na uzorku krvi ispitanika, zatim nenamjernim greškama u samom izvođenju testa, u reagensima koji se koriste te činjenici da ove metode nemaju istu osjetljivost. Osoba također može na serološkim testovima pokazati pozitivitet na kontakt s virusom koji se odvijao u prošlosti, a da u sadašnjosti u samom organizmu virusne čestice više nisu pristune.

U serološke testove spada i testiranje na pristunost viralnih proteina koji u našem organizmu predstavljaju antigene pa se ova testiranja još nazivaju i testovima na SARS-CoV-2 antigen. Antigeni su proteini koji pobuđuju imunološki odgovor a u slučaju ovog virusa testira se na prisutnost proteina koji se nalaze na površini virusa. Najčešće se u testovima koristi test na protein Spike. Ovakvi testovi često su napravljeni u formi široj populaciji poznatijih testova na trudnoću. Ne zahtijevaju laboratorijske uvjete, komplicirane instrumente i izvode se u kratkom vremenu na mjestu testiranja. No jedan od izazova u razvoju ovakvih testova je naći dovoljno specifičan antigen koji će biti karakterističan samo za onaj virus koji nas interesira bez tzv. križne reaktivnosti sa sličnim proteinima drugih srodnih virusa. To je priličan problem, no od razvoja ovih testova se ne odustaje jer jedino oni imaju potencijal da se rade na velikom broju uzoraka u kratkom vremenu. Zbog njihovih tehničkih karakteristika nikada neće biti ni približno precizni i osjetljivi kao  qPCR, pogotovo neće biti pogodni za testiranje asimptomatskih osoba, no smatra se kako će ipak moći detektirati one kod kojih je infekcija u punom zamahu a takvi su ujedno i najopasniji za okolinu u smislu potencijala za širenje zaraze. Dodatno, ovakvi testovi bit će brzi i jeftini pa bi ih se moglo koristiti primjerice na dnevnoj bazi u školama i pri testiranju zaposlenika ili pri prelasku granice.

I vratimo se vijesti s početka teksta. Upravo u ovu kategoriju spada i prije nekoliko dana u SAD odobren test renomirane tvrtke Abott koja je dugogodišnji lider u molekularno-dijagnostičkim testovima i instrumentima. Prema prijavi proizvođača radi se o 15-min testu kojim se detektira SARS-CoV-2 antigen. Test ne traži poseban laboratorij, može se raditi na terenu, cijena u SAD bit će 5 dolara i mjesečno se može proizvesti i 50 milijuna testova prema sadašnjim kapacitetima. Test dolazi s malenim ‘čitačem’ u koji se stavlja uzorak brisa i reagens koji služi kao fluid kojim se uzorak doprema do „trakice“ na kojoj se nalaze specifična protutijela upravo za SARS-CoV-2. Vezanje virusa na ova protutijela daje obojani signal koji označava da se u uzorku nalaze proteini SARS-CoV-2 virusa. U videu koji slijedi na jednostavan način prikazana je logika takvih testova i njihov konačni rezultat.

Kako sam prije rekla, antigenski testovi su do sada bili manje točni u odnosu na PCR testove, no prema informacijama proizvođača ovaj test identificira 97.1% ljudi u kojima je prisutan virus, dakle onaj dio do 100% čine lažno negativni testovi. Također kada se radi o lažnom pozitivitetu testa, prema informacijama proizvođača 98,5% ljudi koji nema infekciju virusom će biti negativni na testu dok ostatak čine oni koji će unatoč tome što u stvarnosti nisu inficirani virusom dobiti pozitivan rezultat testa.

Što se tiče samog uzorkovanja, najviše se koristi bris nazofarinksa za metode detekcije koje se temelje na PCR metodi. Moguće je uzeti i briseve ždrijela, odnosno testirati i uzorke sline no ti uzorci nisu ekvivalentni u smislu količine virusa i mogućnosti njegove detekcije iako se sakupljaju s relativno bliskih mjesta. Uzorkovanje sline je nedavno odobreno od strane američke regulatorne agencije FDA za test koji je razvijen na Sveučilištu Yale. Dobiti uzorak sline nije neugodan postupak, mogu ga prikupiti sami ispitanici a zdravstveni djelatnici koji uzimaju uzorak pri tome nisu izloženi aeorosolu kao kod uzimanja briseva. U serološkim testovima koristi se uzorak krvi što je naravno najinvazivniji tip uzimanja uzorka.

Osjetljivost i specifičnost testa. Kada je osjetljivost niska, test će biti lažno negativan, a kada je specifičnost niska moguće je pokupiti signal i nekog drugog virusa pa će test biti lažno pozitivan

Pojmovi kojima se obično označava kvaliteta nekog testa su osjetljivost i specifičnost. Osjetljivost nam govori da li test točno određuje pristunost virusa. Za svaki test potrebna je minimalna količina virusa koja je granična da test ima pozitivan rezultat. Manje količine neće biti detektirane te će rezultat testa biti negativan, i to lažno jer virusa u uzorku ima ali je količina ispod praga detekcije. Specifičnost govori o tome koliko je dobro i specifično napravljen test upravo za virus koji testiramo, a ne recimo neki drugi slični virus koji može također biti prisutan u uzorku. Ako se neselektivno pokupi signal tog drugog virusa onda je rezultat testa lažno pozitivan iako u uzorku nije prisutan onaj virus koji nas zanima. Ti se parametri za različite metode i proizvođače testova mogu razlikovati a svima je cilj biti daleko preko 90% u oba parametra.

Koliko bi trebalo testirati? Nekako je zdravorazumski, a i preporuka je Svjetske zdravstvene organizacije da bi trebalo svakako testirati više nego manje. U medijima je iznimno bila popraćena vijest kako su Kinezi u Wuhanu napravili COVID-19 bolnicu za tjedan dana, no Wuhan je u rekordnom vremenu od 5 dana napravio i laboratorij za testiranje od 2000 m2 koji može procesuirati više od 10000 uzoraka na dan. Slični laboratoriji su otvoreni i u 12 drugih gradova u Kini stoga je i moguće analizirati velike brojeve uzoraka što je potrebno za tako mnogoljudnu zemlju.

No, postavlja se pitanje smisla tog testiranja ako se ljudi ne pridržavaju, kako se to u medijima voli prikazati, srednjevjekovnih metoda sprečavanja epidemije, poput primjerice držanja distance i nošenja maske. Ako je nešto davno dokazano da donosi rezultate, ne vidim zašto bi se to mijenjalo kao metoda obuzdavanja epidemije. Povećanim testiranjem se zasigurno može otkriti više onih koji su pozitivni a nemaju vanjske manifestacije bolesti, no još nije jasno u kojoj su mjeri opasni kao širitelji zaraze. Kako raste broj napravljenih testova, udio pozitivnih u ukupnom broju neminovno pada jer se zbog manje restriktivih ostalih kriterija koji se moraju zadovoljiti da se uzorak pošalje na testiranje, testiraju i oni za koje realno i nema previše razloga da budu testirani. Dobar primjer su ljudi koji ovih dana prelaze granicu te zbog toga moraju učiniti test na ovaj virus. Jasno je da će ih jako malo biti onih koji su asimptomatski a pozitivni na virus, iako ih zasigurno ima. Ostatak će biti zdravi, kojima je bez stvarne medicinske indikacije napravljen test. S druge strane pak imamo one koje su epidemiolozi na temelju kliničke slike ili bliskih kontakata sa oboljelima i niza drugih kriterija uputili na testiranje i u toj populaciji će udio pozitivnih u ukupnom broju biti svakako veći.  Možemo reći, ok, nema veze, testirajmo sve, no tu se otvara pitanje, koliko često, jer je jasno da bi to mogli raditi i svaki dan a i dalje ne bismo bili sigurni da ćemo obuzdati epidemiju ako se ne budemo držali srednjevjekovnih metoda. Dodatno je pitanje koliko je to opravdano korištenje resursa od reagensa do ljudi koji to rade, a u konačnici i stvaranje troška u cijelom zdravstvenom sustavu.

• Literatura

• https://www.sciencemag.org/news/2020/08/milestone-fda-oks-simple-accurate-coronavirus-test-could-cost-just-5
• Li, X. et al. (2020) Molecular immune pathogenesis and diagnosis of COVID-19. J. Pharm. Anal.10, Issue 2, (April) 102-8.
• Corman, V.M. et al. (2020) Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill., 25, 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.
• World Heath Organization PCR protocol – World Health Organization. https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf?sfvrsn=de3a76aa_2