Tamni proteom. Što zapravo znači da smo pročitali ljudski genom 

Naslovna ilustracija: ‘Osvjetljen’ tamni proteom (EMBL/Lemke Group)

Dr. sc. Tamara Čačev viša je znanstvena suradnica u Zavodu za molekularnu medicinu Instituta Ruđer Bošković. Čačev je također članica Savjeta Ideje.hr

U svibnju je u znanstvenom časopisu Nature izašao rad Deutsch i sur. (doi: 10.1038/s41586-026-10459-x), koji je možda prošao ispod radara, a bavi se “tamnim proteomom”. Naziv je skovan po analogiji na tamnu stranu Mjeseca, a simbolizira onaj dio proteinskih produkata koje naš organizam proizvodi, a donedavno ga nismo bili svjesni, te o njegovoj funkciji još ne znamo ništa. Zamislite, svaka naša stanica proizvodi gomile raznoraznih molekula o kojima pojma nemamo. Ne znamo čemu služe, u kakve interakcije stupaju, možemo li živjeti bez ijedne od njih ili su zapravo jako bitne za ispravno funkcioniranje našeg organizma. Ako su pak nebitne i zamjenjive jedna drugom, zašto se ipak proizvode? Puno pitanja, a vrlo malo odgovora, no nadajmo se još ne zadugo kada se toga dohvati umjetna inteligencija.

Vratimo se malo u povijest, na početak ove priče i početak ovog stoljeća. Kada je prije više od dva desetljeća objavljena prva verzija ljudskoga genoma, jedno od najvećih iznenađenja bio je relativno mali broj proteinskih gena. Umjesto očekivanih stotinu tisuća, ljudski genom sadržavao je približno dvadeset tisuća gena koji prema standardnoj anotaciji nose uputu za sintezu peptida. Povijesno su se ti peptidi nazivali proteinima ako su bili dovoljno dugi, zatim ako su postojali dokazi da imaju nekakvu biološku funkciju, te ako su evolucijski konzervirani, što znači da možemo utvrditi njihovo postojanje u različitim vrstama u evolucijskom slijedu.

Taj se broj tijekom godina dodatno precizirao i danas se uglavnom govori o približno 19.500 gena koji kodiraju tzv. ‘kanonske’ proteine. Tada se smatralo da je veliki dio posla na području analize gena koji kodiraju skup proteina u nekom organizmu, koji nazivamo proteom, uglavnom završen. Neke će se sekvence još ispravljati, otkrivat će se nove izoforme, regulatorni elementi i tkivno specifični transkripti, ali smatralo se da je dio genoma koji kodira proteine relativno dobro okarakteriziran.

Centri koji su sudjelovali u istraživanju. (https://www.nature.com/articles/s41586-026-10459-x/figures/1)

Ipak, iz novog rada međunarodnog konzorcija TransCODE, proistječe teza da je taj zaključak bio preuranjen. Nisu otkriveni novi geni, nego je pokazano da se ribosomi, tvornice za proizvodnju proteina u stanici, koriste s puno više molekula RNA iz ljudskoga transkriptoma nego što postojeće bioinformatičke baze podataka priznaju kao proteinske gene (prema kriterijima usuglašenima konsenzusom samih istraživača.)

Kako bismo shvatili što je ovdje novo, ponovit ćemo osnovne procese u proizvodnji proteina. U našoj DNA pojedini dijelovi čine gene, a dio tih gena kodira proteine. Između te dvije klase molekula postoje molekule mRNA koje prenose informaciju od DNA prema ribosomu na kojem se protein sintetizira. Da bi se neka sekvenca RNA mogla prevesti u protein (translacija), mora sadržavati otvoreni okvir čitanja, odnosno tzv. ORF (open reading frame). U pojednostavljenom prikazu, to je slijed koji započinje inicijacijskim kodonom (kodon je niz od tri uzastopna nukleotida u molekuli mRNA koji stanici služi kao “kod” ili uputa za ugradnju točno određene aminokiseline u proteine) i nastavlja se bez prekida sve do stop-kodona.

Ako krenemo “čitati” sekvencu mRNA od bilo kojeg nasumičnog nukleotida u sekvenci, “tekst” vjerojatno neće imati smisla jer nećemo prepoznati stvarne “riječi”. Odnosno, da se vratimo biologiji, svaki će kodon i dalje odgovarati određenoj aminokiselini ili signalu za završetak translacije, ali će nastali aminokiselinski slijed biti potpuno drugačiji. Takav pogrešno odabran okvir čitanja obično ubrzo nailazi na stop-kodon i najčešće ne daje smislen ni funkcionalan proteinski produkt. Budući da na jednoj molekuli mRNA postoje tri moguća okvira čitanja, kratki otvoreni okviri čitanja mogu se slučajno pojaviti u velikom broju sekvenci. Klasična anotacija proteinskih gena zato se nije temeljila samo na prisutnosti start i stop-kodona. Prednost su imali dugi ORF-ovi, evolucijski očuvane aminokiselinske sekvence, poznate proteinske domene, ekspresija RNA i eksperimentalni dokazi postojanja proteina. No, što je neka analizirana sekvenca kraća, to je teže razlikovati funkcionalni gen od slučajno nastalog otvorenog okvira čitanja.

Otvoreni okvir čitanja omeđen je početnim (START) i završnim kodonom (STOP). Sama prisutnost takve sekvence nije dovoljna da bi se ona proglasila funkcionalnim proteinskim genom. (National Human Genome Research Institute, public domain. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_ORF.png).

Zbog takvih kriterija sustavno su zanemarivani vrlo kratki ORF-ovi te ORF-ovi smješteni u neobičnim dijelovima transkripta. Primjerice, oni koji su se nalazili uzvodno od glavne kodirajuće sekvence, u 5′-netranslatiranoj regiji ili oni koji se preklapaju s poznatim proteinom, ali se čitaju u drugom okviru i na koncu oni koji su smješteni nizvodno od klasičnog stop-kodona. Kako su se znanstvenici ipak vremenom odvažili ući i u ove tamne vode, stvari su se naravno počele komplicirati. Tako su osim klasičnog otvorenog okvira čitanja uvedeni i pojmovi sORF i ncORF – sORF je otvoreni okvir čitanja definiran prvenstveno malom duljinom, iako se pragovi od 100 ili 150 kodona razlikuju među studijama, dok pojam ncORF označava “nekanonski” ORF definiran svojim položajem i odsutnošću iz standardne proteinske anotacije. Može kodirati mali mikroprotein, ali može proizvesti i alternativnu proteinsku izoformu koja nije nužno izrazito kratka.

Prva velika promjena u području nastupila je razvojem ribosomskog profiliranja, odnosno Ribo-seq metode. Ribosom tijekom procesa proizvodnje proteina koji nazivamo translacija, fizički štiti kratak dio RNA od enzimske razgradnje. Sekvenciranjem tih zaštićenih fragmenata moguće je odrediti gdje su se ribosomi nalazili i u kojem su okviru čitali RNA. Kada su očitanja raspoređena s karakterističnom periodičnošću od tri nukleotida te kada se akumuliraju između start i stop-kodona i odgovaraju određenom okviru, to je jak dokaz da u ovom dijelu sekvence mRNA dolazi do aktivne translacije. Ovom je metodom otkriveno na tisuće novih ORFova izvan kanonskih kodirajućih sekvenci. Ipak, to što ribosom čita upute na RNA ne znači nužno da i proizvodi neki stabilan protein. Translacija može biti prekinuta, produkt se može odmah razgraditi, a sam prolazak ribosoma može imati regulatornu ulogu. To je osobito važno za uzvodne ORF-ove, čija translacija često određuje koliko će učinkovito ribosom doći do glavne kodirajuće sekvence istoga transkripta.

Ribosomsko profiliranje određuje koji se dijelovi RNA aktivno prevode analizom fragmenata koje ribosomi štite od enzimske razgradnje. Ribo-seq postupak uključuje zaštitu dijelova RNA ribosomima, uklanjanje nezaštićene RNA, izdvajanje ribosomskih ‘otisaka’ i njihovo sekvenciranje. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:RibosomeProfilejpg.jpg

Sljedeći proboj na ovom polju dala je masena spektrometrija. U konvencionalnoj proteomici stanični se proteini obično razgrade tripsinom, a nastali se peptidi razdvajaju i identificiraju prema masi i fragmentacijskom obrascu. Pronalazak dvaju jedinstvenih peptida iz istog ORF-a znatno je uvjerljiviji dokaz postojanja proteinskog produkta od same prisutnosti ribosoma na nekoj sekvenci RNA. Mali proteini su metodološki problematičniji jer iz njih nakon razgradnje često ne nastaju dva dovoljno duga, jedinstvena i dobro ionizirajuća peptida. Na primjer, u ovoj novoj studiji samo su dva od 36 već poznatih proteina kraćih od 50 aminokiselina mogla zadovoljiti standardne kriterije projekta humanog proteoma (Human proteome project).

U čemu je dakle vrijednost ove nove studije? U ovom radu autori su krenuli od analize 7.264 ncORF-a iz standardiziranog TransCODE kataloga (https://transcodeconsortium.org/). U konvencionalnim, proteazom obrađenim uzorcima identificirali su peptide koji su se mapirali na 183 ncORF-a. Potpuno drugačiju sliku dala je druga primijenjena metoda, imunopeptidomika. Ova se analiza temeljila na premisi da HLA-I molekule vežu kratke peptide koji potječu od unutarstaničnih proteina i translacijskih produkata te ih izlažu na površini stanice. T-stanice na temelju tih kompleksa nadziru što se u stanici proizvodi. Pretraživanjem HLA-peptidoma autori su pronašli 3.116 peptida koji su se mogli povezati s 1.785 ncORF-a. Dakle, za 1.785 ncORF-a postoji dokaz da je njihov translacijski produkt proizveden barem u količini dovoljnoj da njegov fragment bude obrađen i prezentiran uz HLA na površini stanica. No, ovi nalazi nisu dokaz da je nastao stabilan, pravilno složen protein s fiziološkom funkcijom. HLA sustav, među ostalim, prikazuje proizvode defektne, kratkotrajne i brzo degradirane translacije. Imunološki sustav može stoga ‘vidjeti’ molekularne događaje koje konvencionalna proteomika ne registrira. Najzanimljiviji rezultat rada upravo je velika razlika između 183 ncORF-a detektirana u konvencionalnom proteomu i 1.785 ncORF-a detektiranih putem imunopeptidomike i identifikacije HLA-peptida. Ta razlika može djelomično biti tehnička jer imunopeptidomika obogaćuje usku skupinu peptida i smanjuje kompleksnost uzorka. Ali može ukazivati i na situaciju u kojoj brojni nekanonski translacijski produkti možda doista postoje kratko, nakon čega se brzo razgrađuju.

Proteini se unutar stanice razgrađuju na peptide koji se transportiraju u endoplazmatski retikulum, vežu uz HLA-I i izlažu na površini stanice. (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:MHC_Class_I_processing.svg)

Kako nazvati molekulu za koju znamo da je sintetizirana, ali ne znamo je li stabilan i funkcionalan protein? Autori studije su predložili naziv peptidein. Peptidein nije određen posebnom strukturom ili kemijskim svojstvom već se odnosi na ncORF za koji postoje eksperimentalni dokazi translacije i proteinske sinteze, ali još nema dovoljno podataka da se označi klasičnim protein-kodirajućim genom. Termin je koristan jer se njime ne ignoriraju stvarno proizvedene molekule samo zato što ne zadovoljavaju kriterije razvijene za mnogo veće proteine, a opet – nije svaka ribosomska aktivnost ili svaki HLA-peptid automatski novi funkcionalni protein.

Neki će peptideini s vremenom vjerojatno postati priznati proteinski geni. Za druge će se pokazati da su kratkotrajni nusprodukti translacije. Za treće će se možda pokazati kako mogu biti važni samo kao izvor HLA-peptida, bez samostalne unutarstanične funkcije.

Jedan od uobičajenih kriterija za prepoznavanje gena koji kodira neki protein je očuvanje aminokiselinske sekvence između vrsta i tijekom evolucije. Ako promjene aminokiselina smanjuju sposobnost preživljavanja ili razmnožavanja, prirodna će selekcija očuvati važna mjesta u proteinu i takve sekvence se često nazivaju konzerviranim sekvencama. Većina ncORF-ova nema takav jasan signal. To se može interpretirati kao dokaz da nemaju funkciju, ali postoje i druga objašnjenja. Mogu biti evolucijski vrlo mladi, ograničeni na primate ili čak samo na čovjeka. Mogu djelovati preko vrlo kratkog motiva dok je ostatak sekvence podložniji potencijalnim izmjenama. Autori zato uvode i pojam ORBL kao mjeru očuvanosti ‘otvorenosti’ okvira čitanja. Odnosno, jesu li kroz evoluciju sačuvani inicijacijski kodon, stop-kodon i odsutnost prekida unutar ORF-a. Visok ORBL signal pronađen je u mnogo većem broju ncORF-ova nego klasičan signal očuvanja aminokiselinske sekvence.

Najdetaljnije je u radu analiziran kandidat koji se nalazi u transkriptu OLMALINC, odnosno LINC00263, koji je do sada bio klasificiran kao duga nekodirajuća RNA. U njemu se nalazi nekoliko mogućih ncORF-ova, ali samo je jedan, c10riboseqorf92, pokazao snažan učinak u funkcionalnim probirima. Njegovo genetičko uklanjanje uzrokovalo je gubitak vijabilnosti u velikom broju tumorskih i transformiranih staničnih linija. Analize ekspresije povezale su ga s procesima mitoze, kromosomske regulacije, metabolizma i odgovora na oštećenje DNA. Ali neposredni molekularni mehanizam njegovog djelovanja još nije poznat. Ne zna se gdje se taj produkt nalazi u stanici, s kojim molekulama izravno stupa u interakciju ni kakvu ulogu ima u normalnim stanicama. Kako podaci dolaze uglavnom iz tumorskih stanica, ova molekula može biti specifična upravo za njih, bez prisutnosti/funkcije u normalnim stanicama. U tumorima su jako izmijenjene gotovo sve razine regulacije genske ekspresije: transkripcija, izrezivanje introna i spajanje eksona, inicijacija translacije, izbor startnog kodona, kontrola kvalitete RNA i razgradnja proteina. Zbog toga ga autori ipak nisu proglasili novim proteinskim genom.

Jasno je da u tumorskim stanicama može biti prezentiran skup peptida koji nije prisutan u normalnim stanicama. Takvi se peptidi često nazivaju kriptičnim antigenima. Nisu svi neoantigeni u strogom smislu. Klasičan neoantigen nastaje iz somatske mutacije i zato ima novu aminokiselinsku sekvencu. Nekanonski antigen može imati potpuno ‘normalnu’ sekvencu, ali se prezentira samo u tumoru zato što je odgovarajući ORF ondje eksprimiran. To pokazuje da “tamni proteom” može biti posebno važan za tumore s malim brojem mutacija. Tumor možda nema mnogo klasičnih mutacijskih neoantigena, ali može imati abnormalan translacijski program koji stvara nove HLA-peptide. Ovo daje nadu da bi takvi antigeni mogli biti selektivne mete za ravoj novih ciljanih antitumorskih terapija.

Rad pokazuje koliko je velika razlika između informacije o sekvenci i njezine biološke interpretacije

Na prvi pogled, pitanje postoje li u ljudskim stanicama još tisuće sitnih, slabo poznatih translacijskih produkata može djelovati kao uska rasprava o anotaciji genoma. Međutim, pravo je pitanje što zapravo znači kada kažemo da smo ‘pročitali’ ljudski genom? Sekvencu ljudske DNA poznajemo već neko vrijeme, no to je kao da znamo gotovo sva slova, ali još ne znamo sa sigurnošću gdje počinju i završavaju sve rečenice pa stoga i ne shvaćamo u potpunosti smisao onog što je napisano. Ovaj rad pokazuje koliko je velika razlika između informacije o sekvenci i njezine biološke interpretacije.

Autori su analizirali 7.264 nekanonska otvorena okvira čitanja i za približno četvrtinu pronašli peptide u velikoj zbirci proteomskih i HLA-imunopeptidomskih podataka koje prethodno nismo uopće ‘doživljavali’. U kontekstu ovog novog rada tamni proteom je zapravo nekanonski ili neanotirani dio proteoma. Ove regije genoma nisu do sada bile potpuno nepoznate, no ono što je nedostajalo jest da li oni uistinu daju smislene i funkcionalne proteinske produkte. Mikroproteini su desetljećima bili zanemarivani i zato što su metode istraživanja bile prilagođene većim proteinima. Kratak protein proizvodi malo peptida pogodnih za detekciju masenom spektrometrijom. Može se brzo razgraditi, biti prisutan samo u određenom tkivu ili kratkom razvojnom razdoblju ili se stvarati samo u uvjetima stresa.

Velik dio molekularne dijagnostike i dalje daje prednost varijantama u poznatim protein-kodirajućim regijama. Promjenu u ‘nekodirajućoj’ često će se teže interpretirati, osim ako postoje jasni dokazi da utječe na splicing, ekspresiju ili drugi poznati regulatorni proces. Ako se u nekima od tih područja nalaze stvarni ORF-ovi koji vode do proteinskog produkta s nekom funkcijom, pojedine genske varijante koje su do sada smatrane neutralnima bi mogle postati funkcionalno bitnima. To otvara prostor da se ipak pomaknemo u razjašnjavanju molekularne osnove nasljednih bolesti za koje je molekularna etiologija još neutvrđena.

Analize na razini ribosoma u ovom radu pokazuju kako se RNA za ove potencijalne proteine čita dok prisutnost HLA-peptida pokazuje da je nastao produkt koji je obrađen i prezentiran u stanici. Set molekula koje su do danas metodama konvencionalne proteomike izmicale karakterizaciji sada će možda ipak biti okarakteriziran. Pokazano je i da postoji evolucijska očuvanost tih molekula što sugerira selekcijski pritisak koji je indikator da se ipak radi o bitnim molekulama. Ova studija je pokazala da se granica između kodirajućeg i nekodirajućeg ipak može pomicati korištenjem novih metoda i pristupa.

Tek slijedi veliki eksperimentalni posao jer se treba utvrditi koji od kandidata su samo rezultat prolazne translacije, koji su tumorski antigeni koji u normalnim stanicama ne postoje, a koji će nakon detaljne funkcionalne analize vjerojatno dobiti status stvarnih proteinskih gena, funkcionalnih u normalnim stanicama.

Literatura:

1) Deutsch EW, Kok LW, Mudge JM, Valls CF, Jungreis I, Ruiz-Orera J, Sun Z, Kusebauch U, Fierro-Monti I, Abelin JG, Alba MM, Aspden JL, Bandyopadhyay S, Banerjee K, Baranov PV, Bazzini AA, Bourassa F, Bruford EA, Calviello L, Carr SA, Carvunis AR, Chothani S, Clauwaert J, Dean K, Faridi P, Frankish A, Goodale A, Green T, Hubner N, Ingolia NT, Kellis M, Magrane M, Martin MJ, Martinez TF, Menschaert G, Ohler U, Orchard S, Potter A, Rackham OJL, Rees MG, Root DE, Roth JA, Roucou X, Sialana FJ, Slavoff SA, Świrski MI, Tierney JAS, Trifiro FA, Valen E, Vasylieva V, Wacholder A, Wang S, Wang L, Weissman JS, Wu W, Xie Z, Choudhary JS, Bassani-Sternberg M, Vizcaíno JA, Ternette N, Brunet MA, Moritz RL, Prensner JR, van Heesch S. Expanding the human proteome with microproteins and peptideins. Nature. 2026 May 6. doi: 10.1038/s41586-026-10459-x.

2) Mudge JM, Ruiz-Orera J, Prensner JR, i sur. Standardized annotation of translated open reading frames. Nature Biotechnology. 2022;40:994–999. doi: 10.1038/s41587-022-01369-0.

3) Martinez TF, Chu Q, Donaldson C, i sur. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature Chemical Biology. 2020;16:458–468. doi: 10.1038/s41589-019-0425-0.

4) Ely ZA, i sur. Pancreatic cancer-restricted cryptic antigens are targets for T cell recognition. Science. 2025;388:eadk3487. doi: 10.1126/science.adk3487.